中铁一局集团咸阳中心医院外一科(咸阳 712000) 惠均武 高小鹏 马清涌 王云检

大肠癌患者常存在不同程度的代谢紊乱、营养不良和免疫功能低下。普通肠外营养虽能改善患者的营养状况,但亦能刺激肿瘤细胞的分裂、增殖。20世纪 90年代以来,一系列的相关研究表明,某些营养物质不仅能防治营养缺乏,而且能以特定方式刺激免疫细胞增强免疫应答,抑制肿瘤细胞生长。目前研究较多并已开始应用于临床的营养素包括精氨酸等。早在 1974年Morson就提出了腺瘤→癌顺序,积极诊治大肠腺瘤是控制和减少大肠癌发病的重要途径。目前除了手术切除腺瘤以外尚无良好的药物预防大肠腺瘤到癌的转变。

资料与方法

1 实验对象 选择 2003年 8月至 2004年 2月在西安交通大学医学院第一附属医院住院治疗的大肠癌和腺瘤患者各 60例,均经病理学确诊,随机分为两组:实验组、对照组各 30例。两组患者年龄、性别、发病部位、病理类型均无显著性差异。患者均在干预前半年内未使用免疫抑制剂和增强剂;干预前未使用化疗、放疗;术中未切脾;无内分泌、代谢性疾病。

2 给药方法 实验组患者每日口服 L-精氨酸30g(120ml),对照组患者每日口服 5%葡萄糖液120ml,连续 3d。

3 标本采集 病理标本:用药前、后一日内分别取癌旁组织(距肿瘤旁 5cm以内),肿瘤组织,制成石蜡标本。血液标本:用药前、后一日内抽取外周静脉血,肝素抗凝立即送检。

4 SP免疫组化法检测 Ki67和 iNOS的活性

标本用福尔马林固定,石蜡包埋,4 μ m连续切片。按试剂盒使用说明书进行免疫组化 SP法操作。阳性的判定:Ki67以细胞核出现棕黄色颗粒为阳性,iNOS以细胞质、膜出现棕黄色颗粒为阳性。标记指数计算方法:双人盲法观片,随机选取 10个高倍镜视野共计数 1 000个细胞,以阳性细胞所占百分数,计算标记指数。标记指数(Labeling Index)=染色阳性细胞数 /1000×100%。

5 Griess法测定大肠肿瘤患者血清 NO浓度取血浆 0.5ml加 75mmol◦ L-1硫酸 20ml摇匀 3 000r◦ min-1×10min离心,取上清 2ml加 1ml酸化的 10g◦ L-1对氨苯磺酸和 1ml酸化的 10g◦ L-1萘乙胺,37℃下反应 10min,紫外 751分光光度仪 545nm处测定NO含量。

6 统计学分析 Ki67、iNOS标记指数、血清 NO浓度用均值±标准差表示,采用 SPSS10.0软件进行 t检验,P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 L-精氨酸对大肠腺瘤组织 Ki67、iNOS表达的影响 见表 1。干预前两组大肠腺瘤组织 Ki67、iNOS标记指数比较差异无统计学意义;干预后,实验组Ki67标记指数明显降低、iNOS标记指数明显升高,组内比较、与同期对照组相比差异均有统计学意义(P＜0.05),对照组干预前后无明显变化。

表1 大肠腺瘤实验组与对照组 Ki67、iNOS表达检测结果

2 L-精氨酸对大肠癌组织 Ki67、iNOS表达的影响 见表 2。干预前两组大肠癌组织 Ki67、iNOS标记指数比较差异无统计学意义;干预后,实验组 Ki67标记指数明显降低、iNOS标记指数明显升高,组内比较、与同期对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05),对照组干预前后无明显变化。

表2 大肠癌实验组与对照组 iNOS、Ki67表达检测结果

3 L-精氨酸对大肠肿瘤患者血清 NO浓度的影响 见表 3。干预前两组大肠癌患者血清 NO浓度比较差异无统计学意义;干预后,实验组血清 NO浓度明显升高,组内比较、与同期对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05),对照组干预前后无明显变化。干预前、后大肠腺瘤患者血清 NO浓度无明显变化。

表3 实验组与对照组血清 NO浓度检测结果 (μ mol/L)

讨 论

Ki67是应用广泛的细胞增殖标记。Ki67抗原的量随细胞周期的不同而发生改变,在 G1中期到后期出现表达,S期和 G2期逐渐增加,有丝分裂期达到高峰,分裂后迅速降解或丢失抗原决定簇。现认为 Ki67的功能与染色质相连,与细胞的有丝分裂有关。 Ki67在大肠肿瘤研究中得到了广泛应用,大肠增生性息肉、腺瘤、腺瘤并部分组织癌变、腺癌的一份研究表明,随腺瘤不同程度的异常发育 Ki67标记指数逐渐增高,直至腺癌最高,可达 50%,各组别间存在显著性差异[1]。Van Triest等[2]认为 Ki67与病人的年龄、性别、Dukes分期、血管浸润、分化程度等特征均有很好的相关性。有研究表明,L-精氨酸可抑制肿瘤的生长。马清涌等[3]在研究 L-精氨酸对 Wistar大鼠实验性结肠癌的作用及其机制中发现 L-精氨酸可明显降低结肠癌的体积,减少侵犯到粘膜下层的腺癌数量。庄岩等[4]研究 L-精氨酸对小鼠 S180移植瘤生长的影响时发现补充 L-精氨酸组可产生较谷氨酰胺组与 L-Arg-NAME组显著较小的瘤重。本实验发现,补充 L-Arg后大肠癌组织、癌旁组织及腺瘤组织中 Ki67表达明显减小(P＜0.05),提示 L-精氨酸具有抑制大肠肿瘤 Ki67表达的作用,从而抑制大肠肿瘤生长的作用。

近年来,有人提出 NO具有抗肿瘤作用。为了研究NO对肿瘤的影响,Jenkins等[5]采用基因工程技术,把iNOS基因转染入人结肠癌细胞株,成为 iNOS-19细胞克隆,使其能持续分泌 NO,并与不产生 NO的亲代野生型瘤株进行体外和体内生长特性比较。在体外培养中,iNOS-19细胞克隆增殖速率较野生型亲代对照组和转染对照组慢。这种作用可使被 NOS抑制剂 LNIO逆转,说明在体外培养中 NO能抑制肿瘤细胞增殖。Xie等[6]研究发现,给高度转移的小鼠恶性黑色素瘤细胞转染 iNOS基因,使其表达 iNOS活性。当产生高水平 NO时,则使肿瘤失去转移性。 Jansson等在研究卡介苗(BCG)治疗膀胱癌的实验中,证实 BCG是通过增加膀胱上皮细胞的细胞因子产量,诱导 iNOS活性增加,进一步使 NO产生增加而发挥作用的。本实验发现,补充 L-Arg后大肠癌组织、腺瘤组织 iNOS表达明显升高(P＜0.05),提示 L-精氨酸具有促进大肠肿瘤iNOS表达的作用。本实验也发现补充 L-Arg后大肠癌患者血清中的 NO的浓度明显升高(P＜0.05)。NO是由 NOS催化 L-Arg生成的。NO含量的动态变化是由 NOS的活性决定的,即 NOS活性越强,NO浓度越高。L-Arg可能通过促进大肠肿瘤 iNOS表达来升高血清 NO的浓度。腺瘤患者血清 NO含量干预前后没有明显变化,但腺瘤组织 iNOS表达活性升高,有可能使肿瘤组织局部产生高浓度的 NO。由此看来,L-精氨酸—一氧化氮途径是 L-精氨酸抑制肿瘤生长的一种作用机制,L-精氨酸对 iNOS表达的调节机制有待于进一步研究。

[1] Kikuchi Y,Dinjens WW,Bosman FT.Proliferation and apoptosis in proliferative lesions of the colon and rectum[J].Virchous Arch,1997,431(2):111.

[2] Van Triest B,PinedoHM,Blaauwgeers JL,et al.Prognostic role ofthymidylatesynthase, thymidine phosphorylase platelet-derived endothelialcellgrow factor and proliferation markers in colorectal cancer[J].Clin Cancer Res,2000,6(3):1063.

[3] 马清涌,王亚峰,徐 军,等.L-精氨酸对实验性结肠癌的作用与机理 [J].西安医科大学学报,2001,22(6):532-534.

[4] 庄 岩,赵建勋,王文治,等.外源精氨酸摄入对移植瘤生长的抑制作用[J].中国现代医学杂志,2001,11(12):1-4.

[5] Jenkins DC,Charbs IG,Thomsen LL,et al.Roles of nitric oxide in tumor growth[J].Proc Natl Aced Sci USA,1999,92:4392-4396.

[6] Xie K,Huang S,Dong I,et al.Transfection with the inducible nitric oxide synthase gene suppresses tumorigenicityand abrogates metastasesby K-1735 murine melanoma cells[J].J Exp Med,1998,81:1333-1343.