李一生，朱长清

（1.黑龙江省绥化市北林区畜牧局，黑龙江 绥化 152000；2.北京德佳牧业科技有限公司，北京 100098）

日本脑炎病毒（JEV）又称乙型脑炎病毒，由乙型脑炎病毒引起的流行性乙型脑炎简称乙脑。乙脑病毒在分类上属于黄病毒科（Flaviviridae）黄病毒属（Flavivirus）成员，乙型脑炎病毒基因为单股正链RNA，病毒颗粒呈球形，有包膜，直径40～60 nm，病毒粒子呈20面体对称。猪是乙脑病毒的中间宿主，带毒猪是本病的传染源，临床上以引起母猪发生流产、死胎、木乃伊胎，公猪发生睾丸炎为特征。乙脑是一种人畜共患的自然疫源性疾病，能够引起中枢神经系统感染，对人类危害巨大，据统计全球每年平均发病50 000人，死亡15 000人，尤其在农村地区，死亡率更大。

1 JEV的流行特点

日本脑炎病毒于1870年在日本首先发现[1]。于1935年从患有乙型脑炎死亡病人、死马的脑组织和蚊虫中分离到该病毒，首次确定了乙型脑炎的病原。我国于1949年在北京首次分离得到乙脑病毒，随后在我国其他地区也相继分离到该病毒[2]。乙型脑炎病毒的流行地域很广，主要流行于远东及东南亚国家和地区[3－4]。韩国、泰国、印度尼西亚的爪哇岛、台湾、俄罗斯西伯利亚的滨海地区等相继有乙脑的报道，在印度西北和西南的Kerala和Haryana州也有报道乙脑的流行[5－7]。近年澳大利亚本土和美国的关岛地区也出现乙脑病例[8]。表明该病的流行区域在不断扩大，成为严重的公共卫生问题。世界卫生组织已把JEV疫苗确定为优先研究和开发的项目之一，如何选择合适的乙型脑炎疫苗防治JEV感染，是当今人们在该领域研究的热点问题，近年来我国对JEV进行了大量研究。在JEV活疫苗的研究方面我国居于世界领先水平。余永新等研究成功的JEV活疫苗SA14－14－2株已大量用于人群，这一成果使我国的乙脑发病率显著下降[9]。因此深入研究中国流行乙脑病毒的分子生物学，对于了解亚洲乃至全世界的乙脑病毒的特性具有举足轻重的作用。

2 JEV结构蛋白的特点

目前还没有治疗乙脑的有效药物，接种乙脑疫苗是控制乙脑的重要措施。国际上广泛使用的乙脑疫苗主要是灭活苗，我国使用的主要是SA14－14－2株原代地鼠肾细胞减毒活疫苗。这两种疫苗都存在一些缺点，诸如过敏反应，造价昂贵等，因此研究一种经济、有效、安全的疫苗成为必然趋势。

E蛋白是乙脑病毒的囊膜蛋白，已经证明E蛋白是与细胞膜受体相结合而与细胞膜融合使病毒进入细胞的主要蛋白，与病毒的吸附、侵入、致病性、组织嗜性、血凝反应、血清特异性和诱导宿主的免疫应答等紧密相关。乙脑病毒E基因编码病毒包膜糖蛋白，糖蛋白的活性区域由3个Domain、411 个氨基酸残基组成[10－11]。Kolaskar等学者的研究结果显示，乙脑病毒包膜蛋白的三维结构主要由三个结构域DomainⅠ、Ⅱ、Ⅲ组成，结构域Ⅰ为E1～E51、E137～E196、E293～E311；结构域 Ⅱ 为 E52～E137、 E197～E292； 结 构 域 Ⅲ 为E310～E411[8]。结构域Ⅲ独立地在病毒表面折叠成为疫球蛋白样的结构，由于这种构象，许多抗原中和表位都集中于这一结构域。其中DomainⅢ参与受体结合，是重要的抗原决定簇；DomainⅢE327位点又是决定抗原性的关键位点[11]。抗原中和表位的研究主要集中于结构域Ⅲ，以往学者对这一区域的研究显示，E333、E373～395以及E306、E331和E387都与病毒的中和活性直接相关[12－14]。通过强弱毒株E蛋白氨基酸序列分析，E蛋白上E138、E176、E315、E439位点上氨基酸的突变在病毒减毒过程中起了重要作用[15]。确定JEV毒性的10个关键性氨基酸的位置均在E蛋白上，分别位于E107、E135、E138、E176、E177、E232、E244、E264、E279、E315、E439、E447。Wu 等利用噬菌体呈现技术，从肽库中筛选对病毒单抗高亲和力的肽段，确定病毒在结构域Ⅲ中的中和位点主要集中在 E337～E345、E377～E382、E397～ E403这3个区域内[13]。在这一区域发生的变异会导致抗原性的改变，甚至影响抗原与中和抗体的结合反应，而中和抗体在预防乙脑中起主导作用[16]。

3 JEV毒株分类的特点

国际上乙脑病毒的基因分型采用Chen等学者建立的基因分型法，选择位于PrM区的乙脑病毒基因组456～695位的240个核苷酸长度序列作为基因分型的基础[17－18]。由于乙脑病毒在这一该区段所受进化压力较小，可以采用该区段来反映乙脑病毒的自然进化状况。乙脑病毒以此分为泰国北部及柬埔寨地区分离的毒株属于基因Ⅰ型；来自于泰国南部、马来西亚、印度尼西亚的毒株形成基因Ⅱ型；来自于日本、中国等地区的毒株属于基因Ⅲ型；部分印度尼西亚的JKT6468毒株独自形成了基因IV型[17]。我国病毒学者曾分离出多株乙脑病毒，且研究证实这些毒株间免疫原性存在差异，而以SA14－14－2株为疫苗毒株生产疫苗，应用于JEV的疾病控制起到了一定的保护作用[6]。

乙型脑炎病毒的分类有着明显的地域性，相同的国家和地区分离到的毒株的相似性很高[19－21]。日本于1935年分离第一株JEV Nakayama及其后分离JEV都属于基因Ⅲ型，期间1991年分离株JaOArK36291属于基因Ⅰ型，从1994年后分离的所有毒株均属于基因Ⅰ型[22]。韩国报道1991年前所分离的JEV属于基因Ⅲ型，1994年的分离的2个毒株属于基因Ⅰ型[23]。我国以往分离的JEV属于基因Ⅲ型[24]。但是近十多年来，乙脑病毒基因型的地区有了新的变化，2001年从上海市奉贤县采集的三带喙库蚊中新分离的7株JEV属于基因Ⅰ型[25]。2002和2007年在辽宁先后分离到基因Ⅰ型乙脑病毒，也是东北地区首次分离到基因Ⅰ型的乙脑病毒[26－27]。2000年澳大利亚分离的病毒株分别属基因Ⅰ、Ⅱ型并报道首例乙脑病毒的分子生物学特性[5]。

4 JEV的治病机制及诊断方法

4.1 治病机制

当携带乙脑病毒的蚊虫叮咬动物或人后，病毒随着蚊虫唾液进入皮下，先在局部毛细血管壁内皮细胞及淋巴结等处的细胞中增殖，随后少量病毒进入血流形成短暂的第一次病毒血症，但仅有少数感染者发展成为显性感染[28－30]。感染后是否发病起决于入侵病毒的数量、病毒强度及机体的免疫状况。当机体抗病能力强时，病毒即被消灭，临床上也不表现症状，成为隐形的病毒携带者。当机体的抵抗力低时，病毒可能随血液散布到肝脏、脾脏等组织细胞中继续繁殖，如果被感染者是抵抗力很低的幼儿、老人等，病毒就可通过血脑屏障进入脑组织内增殖，引起中枢神经系统的病变。病毒进入脑内，增殖达到一定数量时造成脑损伤，表现出病症。

乙型脑炎的主要预防措施是防蚊、灭蚊和免疫接种。灭蚊是防治乙型脑炎的重要措施，灭蚊的方法主要是药物法、生物法和生态学方法，但是彻底灭蚊是不现实的，免疫接种是预防乙型脑炎的最重要最有效的措施。猪是乙型脑炎传播过程中的重要宿主，乙脑病毒的感染呈现猪→蚊→人的链状结构。我国自1968年对人使用乙脑疫苗接种，明显地控制了乙型脑炎的流行。目前应用最为广泛的是鼠脑灭活疫苗，原代地鼠肾灭活疫苗和原代地鼠肾减毒活疫苗。

4.2 诊断方法

4.2.1 临床诊断

乙型脑炎有严格的季节性，发生呈散在性，有明显的脑炎症状，怀孕母猪发生流产、死胎、过临产期不生，公猪发生睾丸炎。死后取大脑皮质、丘脑和海马角进行组织学检查，发现非化脓性脑炎等，可作为诊断的依据。肉眼病变主要在脑、脊髓、睾丸和子宫。脑膜和脑质充血、出血、水肿。肿胀的睾丸实质充血、出血和坏死灶。流产胎儿常见脑水肿、腹水增多，皮下有血样浸润，胎儿大小不等，有的呈木乃伊化[31－32]。

4.2.2 病原学诊断

病毒的分离鉴定是诊断乙脑病毒感染最直接、最传统的病原学方法。从发病初期的患者血液、尸体脑组织均可分离到乙脑病毒。分离病毒可用BHK－21、非洲绿猴肾细胞（Vero）等。病毒分离还可以采用乳鼠脑内接种的方法，但敏感性低于细胞分离。在本病流行初期，采取发热期血液，立即进行鸡胚卵形黄囊接种或1～5日龄乳鼠脑内接种，可分离到病毒，但分离率不高。分离到病毒后可以采用反向被动血凝试验、免疫细胞化学法、荧光抗体染色法、胶体金免疫层析试纸条法、RT－PCR技术、Real－Time PCR技术和基因芯片技术等方法对其进行进一步确认[33－34]。

4.2.3 血清学诊断方法

血清或脑脊液中乙型脑炎特异性抗体检测是最常用和有效的诊断方法。特异性抗体的检测方法包括血凝抑制试验、补体结合试验、中和试验、乳胶凝集试验、酶联免疫吸附试验、间接免疫荧光试验等。

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