张孝平，张文静，陈宝安* ，柏志斌，冯继峰，程 璐

(1东南大学医学院附属中大医院，南京210009;2东南大学医学院肿瘤系;3江苏省肿瘤研究所;4东南大学生物科学与医学工程学院生物电子学国家重点实验室)

胰腺癌(PC)临床发病隐匿，发展迅速，预后极差。据统计，2009年美国新增PC患者42 470例，83%的患者在1年内死亡［1］。目前，手术切除是PC唯一可治愈性方法，但85%的患者就诊时已属晚期或发生远处转移，手术切除率为10% ～15%。因此，化疗在PC综合治疗中占有重要地位。近年来，尽管PC的一线化疗方案多以吉西他滨为基础，但氟尿嘧啶类药物5-FU、卡培他滨等仍是PC化疗中最常用药物。二氢嘧啶脱氢酶(DPD)及亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)是氟尿嘧啶类药物体内代谢的关键酶，为探讨PC细胞株中二氢嘧啶脱氢酶(DPYD)基因、MTHFR基因的单核苷酸多态性(SNPs)位点基因型，2010年12月～2011年8月，我们进行了相关研究。现报告如下。

1 材料与方法

1．1 材料 新生小牛血清(杭州四季青公司)，RPMI-1640液(美国 Gibco公司)，0．25%胰酶(Sigma公司)，DNA 提取试剂盒、dNTP、Taq DNA 酶(德国Qiagen公司)。

1．2 方法

1．2．1 细胞培养及基因组DNA提取 PC细胞株SW1990、PANC-1、CFPAC由东南大学医学院实验室传代培养。将细胞接种于10%小牛血清RPMI-1640培养液，置37℃、5%CO2、95%湿度培养箱中培养，贴壁细胞用0．25%胰蛋白酶消化传代。采用德国Qiagen公司产试剂盒提取基因组DNA。

1．2．2 PCR扩增及产物纯化 采用Assay Designer软件设计PCR引物，PCR引物由上海邃志公司合成，PCR引物序列(略)。PCR反应体系中含有5 ng模板 DNA 的 1 μl、水 0．95 μl、PCR 缓冲液 0．625 μl、2．5 mmol/L 的 dNTP 1 μl、25 mmol/L 的 MgCl20．325 μl、PCR 引物 1 μl及 HotStar Taq 酶 0．1 μl。PCR反应条件为:94℃预变性15 min，94℃变性20 s、56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共进行45个循环;最后72℃延伸3 min。反应体系包括1．53 μl水、0．17 μl SAP 缓冲液、0．3 U 碱性磷酸酶;该反应在37℃进行40 min，然后85℃、5 min使该酶失活。……