张忠梁，张名昌，白云凤，闫建俊，冯瑞云

（1.山西大学生物工程学院，山西太原030006；2.山西省农业科学院作物科学研究所，山西太原030032）

植物的光合产物是人类赖以生存的物质基础。根据光合作用中CO2的同化途径，植物可分成C3，C4和CAM三类。C3植物通过1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）催化1,5-二磷酸核酮糖（RuBP）羧化，直接同化大气中的CO2，产生2个三碳化合物3-磷酸甘油酸，该途径称为C3途径（或卡尔文循环）[1]。Rubisco还催化加氧反应，使羧化合成的碳水化合物被氧化，固定的能量重新被释放。Rubisco催化反应的双重性以及对CO2的高Km值是C3植物低光合效率的主要原因。C4植物CO2的初始固定由位于叶肉细胞的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）所催化，该酶对CO2的结合能力特别强，催化空气中的CO2与其受体磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）形成四碳化合物草酰乙酸（OAA），该途径称为C4途径。在C4途径中，OAA经叶绿体中的NADP-苹果酸脱氢酶（NADP-MDH）还原为苹果酸（MA），MA再转运至鞘细胞中脱羧，释放出的CO2进入C3循环被Rubisco固定，而余下的三碳产物（丙酮酸）重新运回叶肉细胞的叶绿体内，在磷酸丙酮酸二激酶（PPDK）催化下形成CO2受体PEP。C4循环增加了维管束鞘细胞中CO2的浓度，同时提高了Rubisco的羧化活性，抑制了它的加氧活性，使C4植物保持较高的光合效率[2]。

一些主要农作物如水稻、小麦、马铃薯、甜菜等均为C3作物，较低的光合效率成为限制其产量进一步提高的重要内在因素之一。通过提高光合作用效率来增加作物产量一直是国际上光合作用研究和作物遗传育种研究的热点之一。自20世纪60年代以来，人们试图通过常规杂交育种手段来改进C3植物的光合效率，但未取得预期结果。近年来，基因克隆和转基因技术逐步完善，为改善作物光合效率提供了新途径。本文就该方面的研究进展作一综述。

1 Rubi sco的修饰与改造

Rubisco广泛分布于具有光合功能的细胞器中。在C3植物中，Rubisco主要存在于叶肉细胞的叶绿体间质中，在基粒片层上也有少量分布。在C4植物中，Rubisco则定位于维管束鞘细胞中的叶绿体间质内。Rubisco由多个大亚基和小亚基组成，大亚基具有催化功能，小亚基仅具有调节作用。Rubisco催化C3途径的第1步，即把CO2分子共价结合到底物RuBP（1，5-二磷酸核酮糖）上，形成3-磷酸甘油酸。但其羧化反应速度每秒只有2～3次，与一般的酶促反应速度（每秒25 000次左右）相比，效率极低。Rubisco是一种双功能酶，还催化另外1个反应（即加氧反应，即Rubisco不与CO2结合而是与O2结合，除消耗能量外，还损失羧化反应中固定的20%～50%的有机碳）。

提高Rubisco同化CO2的效率，抑制其加氧功能，无疑会提高作物产量。许多研究者希望通过基因定点突变改变酶的结构，以改变Rubisco羧化/加氧的比值，但至今仍未获得成功，突变后的酶活性并未显著提高。1994年，Read和Tabita发现在硅藻和红藻中存在的Rubisco具有比高等植物高得多的效率。此后，Uemura等又发现一种嗜热红藻的Rubisco羧化效率约是高等植物的2.5～3倍。在红藻中发现的具有较高效率的Rubisco，为修饰改造Rubisco提供了依据。Whitney等[3]通过质体转化的方法将红藻Rubisco的小亚基编码基因引入烟草的叶绿体中，得到了高效表达，但是表达的小亚基却不能与烟草本身的大亚基组装成全酶。因此，要提高Rubisco的效率需要进一步了解该酶的蛋白结构与其催化效率之间的关系及其大小亚基组装成全酶的修饰机制。

2 C4光合途径中关键酶基因的克隆与转化

C4光合途径中主要涉及3种关键酶，即磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）、磷酸丙酮酸二激酶（PPDK） 和依赖于 NADP的苹果酸酶（NADP-ME）。PEPC可分为C4型、C3型和根型。C4型主要负责C4双羧酸循环途径中固定CO2的初始反应，C4光合循环的关键限速酶[4]。将玉米的C4型PEPC基因导入水稻，叶片的PEPC活性提高了20倍[5]，甚至提高110倍[6]；导入小麦，酶活性提高了3～5倍[7]；导入烟草，酶活性最高提高了2.4倍。将高粱的C4型PEPC基因导入水稻，酶活性提高5～10倍[8]，导入拟南芥[9]，PEPC的活性也比对照有不同程度的提高。将甘蔗的PEPC基因导入烟草，酶活性提高1.5倍[10]。

PPDK分为C4型和胞质型。C4型PPDK基因与胞质型PPDK基因往往有部分重叠[11]，如玉米C4型PPDK基因与胞质型PPDK基因的大部分序列相同，区别在于C4型PPDK基因的上游比细胞质型PPDK基因多1个外显子和1个内含子，外显子编码1个叶绿体导肽，而内含子的部分序列则成为细胞质型PPDK基因的启动子，具有组成型转录活性[12]。将玉米的C4型PPDK基因转入水稻，PPDK的最高酶活力提高了40倍[13]；转入马铃薯，PPDK的最高酶活力提高了5.4倍；转入拟南芥，酶活力提高了4倍。

NADP-ME由1个小的基因家族编码。C4型NADP-ME位于维管束鞘细胞的叶绿体的基质中，通过其脱羧反应生成的CO2被Rubisco重新固定而进入C3循环，是C4途径的另一关键酶。高粱和玉米[14]的NADP-ME基因均在水稻植株中得到了有效表达，水稻转基因植株的生物学产量不仅显著高于非转基因水稻植株，也高于转PEPC基因和PPDK基因的水稻植株[15]。

3 植物高光效基因工程面临的挑战

C4关键酶基因向C3作物的成功导入及其在C3作物中的高效表达，说明利用基因工程手段培育高光效作物品种的可行性，但仍有许多问题需要进行深入系统的研究。如Ku等得到的转基因水稻，其PEPC活力可达玉米的2～3倍，但是除了其抗氧抑制的能力有所增强外，并未发现光合效率有所提高。转基因植物中PEPC活力的提高，必然使其产物——草酰乙酸（OAA）的浓度升高；如果生成的OAA不能迅速脱羧或被转运掉，其PEPC活力就会被OAA强烈抑制，因而就难以实质性地启动单细胞内的四碳双羧酸微循环而有效提高转基因作物中四碳双羧酸浓度，最终不能有效提高光合效率。这些结果表明，要显著提高转基因植株的光合效率，需要引入完整运行的C4循环。为此，需要导入多个C4基因并使其协调表达，或者把含不同C4基因的植株彼此杂交，聚合C4基因。

分析C4基因超量表达的例子，发现单子叶植物玉米、高粱的C4基因在水稻、小麦等单子叶植物中的表达水平一般高于在双子叶植物如烟草、拟南芥中的表达水平，表明系统发生学上的距离有可能影响C4基因在C3植物中的高效表达。对单子叶植物玉米的密码子用法分析表明，其与水稻、小麦等单子叶植物的密码子用法比较一致，与拟南芥、烟草等双子叶植物差异较大[16]。对双子叶植物籽粒苋NAD-ME的密码子用法的研究，发现它与马铃薯、拟南芥、葡萄等双子叶植物的用法较为一致，与玉米、高粱等单子叶植物差异较大[17]。密码子偏好性是生物在长期的进化过程中为适应宿主的基因组环境而形成的。因此，如何选择高光效基因的适宜供体和受体应是高光效基因工程考虑的重要因素之一。

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