龙 淼，李 鹏，朱连勤，王 哲

（1.沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁沈阳 110866；2.青岛农业大学，山东青岛 266109；3.吉林大学畜牧兽医学院，吉林长春 130062）

霉菌毒素污染一直是全球畜牧业和食品工业的重大威胁［1］。据联合国粮农组织（FAO）统计，全世界谷物供应中有25%受霉菌毒素污染而不能食用，由此造成的经济损失高达数千亿美元。玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）毒素是世界上污染最为广泛的一种镰刀菌毒素，在世界各地的谷物以及农副产品中都检测到了ZEN的存在［2］。ZEN一般通过污染的作物进入食物链，可在机体内蓄积，引起一系列雌激素效应症状，当饲料中ZEN浓度达到50μg／kg，就会引起猪卵巢形态改变。ZEN对小鼠血液、肝脏、肾脏也具有严重的毒害作用［3］。反刍动物虽然对ZEN具有较强的耐受性，但ZEN毒素引起的高雌激素症状也有相当多的报道［4］。ZEN还具有致癌性，导致乳腺癌，增加食管癌发病率。从致病机制上来看，它主要通过影响机体的生殖性能，引起细胞凋亡、致畸、损伤DNA、氧化损害、影响免疫机能等机制，来影响动物与人类的健康［5］。目前对玉米赤霉烯酮毒素的检测已经有了很深入的研究，各种检测ZEN的方法层出不穷，但如果从源头上预防ZEN毒素中毒，最好的方法还是对玉米等粮食作物进行脱毒。因此，研究并采用先进的技术对粮食及其副产品进行脱毒，进而预防玉米赤霉烯酮中毒显得尤为重要。

1 玉米赤霉烯酮的脱毒方法

玉米赤霉烯酮毒素自20世纪被发现以来，研究者便不断地研究ZEN毒素脱毒的方法。传统去毒方法有水洗法、高温法、辐照法、压煮法等［6－7］。化学方法包括氨化法、碱法、臭氧处理、双氧水处理、碳酸钠浸泡等。但这些方法效果不稳定，营养成分损失较大，难以规模化生产。采用添加霉菌毒素吸附剂的办法，在吸附毒素的同时会吸附一些营养成分，不能彻底去除ZEN的毒性。因此，ZEN污染的控制急切需要一种高效率、特异性强以及对饲料和环境没有污染的技术［8］。

2 微生物降解ZEN

由于传统的物理、化学方法去除毒素污染存在着不可避免的局限性，利用生物降解法清除ZEN毒素已成为重要的研究方向。生物降解是指霉菌毒素分子的毒性基团被微生物产生的次级代谢产物或者所分泌的胞内、胞外酶分解破坏，同时产生无毒的降解产物过程。这种脱毒的方法不会破坏原料当中的其他成分，不会降低营养价值。因此，生物降解法是去除ZEN最有效及可行的方法。但目前国内外分离到的能降解ZEN毒素的单菌株很少，各个菌株对ZEN的降解能力也有一定的差异。

2.1 降解ZEN毒素的细菌

Megharaj M等［9］在1997年首次报道在泥土中富集的混合细菌培养物具有生物降解ZEN的能力，通过HPLC及ELISA方法没有检测到ZEN及ZEN类似物。他从该混合培养物中分离出了14株菌株，但发现分离的单菌株纯培养没有降解ZEN能力。该富集的混合细菌与ZEN共同孵育之后，将这些菌株重新组合也不具有降解ZEN毒素的能力。该研究首次报道了细菌培养物可以降解ZEN毒素，为今后研究ZEN降解菌奠定了基础。随后，Eldeeb B A等［10］在土壤中也分离到了能够降解ZEN的菌株。目前已经证实，少数乳杆菌、明串珠菌可将ZEN转化为α－zearalenol，但动物试验证明，αzearalenol的雌激素毒性是ZEN毒性的10倍～20倍［11］，因此这种转化并不能看作是去毒性的降解。其他的乳酸菌类菌株能否将ZEN降解为无毒产物还有待于研究。Cho K G等［12］在被真菌毒素污染的谷物、废水和土壤中，分别使用营养琼脂、马铃薯葡萄糖琼脂培养基、溴甲酚紫琼脂培养基来分离筛选能够降解ZEN毒素的细菌、真菌和乳酸菌，最终分离鉴定出能够降解ZEN毒素的一株枯草芽胞杆菌，并对其进行了降解效果测定。研究结果显示，该菌株能在24h内将液体培养基中99%（1mg／kg）的ZEN降解，可在48h内将固体培养基中大于95%的ZEN降解。Yu Y等［13］使用营养肉汤培养基、M1、M2培养基，在土壤中分离到一株能够降解ZEN的菌株，命名为SM04，经16SrDNA序列分析鉴定，SM04属于不动杆菌属。Abdulla D A等［14］报道恶臭假单胞菌（PseuduomonasPutida）能完全降解玉米赤霉烯酮。Samuel E T等［15－16］报道了两株芽胞杆菌B.subtilis168和B.nattoCICC 24640能够降解ZEN，在30℃厌氧条件下培养24 h，能够分别降解81%和100%的ZEN，降解产物无雌激素效应。程波财等［17］在真菌毒素污染较为严重的沿淮两岸20余个县市进行小麦、玉米和土壤样品的采集，通过选择性培养基将纯培养菌株与ZEN毒素进行孵育试验，分离出6株具有降解ZEN潜能的细菌，经过形态学、生理生化和16SrDNA鉴定，在获得的ZEN降解菌中，有一株被鉴定为藤黄微球菌，具有较高的降解ZEN能力。

2.2 降解ZEN毒素的真菌

根霉属菌株和部分丝状真菌及酵母菌在一定条件下可将ZEN转化成α－zearalenol和β－zearalenol，由于β－zearalenol的雌激素活性比ZEN要低很多，β－zearalenol衍生物出现可以看做是一种解毒作用。所以，降解物质毒性小甚至没有毒性可认为该菌株具有降解ZEN毒素的作用。

Molnar O等［18］从白蚁肠道中分离到了一株酵母菌，鉴定是毛孢子菌属中的一个新成员，经研究表明该菌株可在24h内将ZEN降解成CO2或者无荧光和无紫外吸收的代谢物，代谢物中没有检测到αzearalenol、β－zearalenol和ZEN的存在。细胞培养试验显示，该代谢物对MCF细胞无雌激素毒性。之后，Bakutis B等［19］也分离出类似的具有降解ZEN毒素的菌株，该菌株是胶红类酵母菌（Rhodotorula glutinis），可将玉米饲料中的ZEN毒素在10d内从2.20mg／kg降至0.30mg／kg。吴晖等［20］确定了一株具有去除ZEN能力的酵母菌株CLY01。该酵母在添加了ZEN的培养基中进行发酵，采用HPLC法检测发酵液中ZEN的浓度，发现该菌株发酵96h后，培养基中的ZEN浓度从3.893mg／L降低至0.125mg／L，去除率达到96.79%。

可以看出，能够降解ZEN毒素的主要是细菌、真菌，但各个菌株的降解能力不同。因此，对于今后的研究还需要分离得到大量能够降解ZEN毒素的单菌株，研究其降解ZEN毒素的特性，或者将能够降解ZEN毒素的菌株进行组合试验，期待得到最大降解ZEN毒素的组合型菌株，并需要研究其安全性，进而作为微生态添加剂应用于饲料及粮食工业中。

3 微生物降解ZEN毒素的降解机制

目前认为，各种降解菌的降解机制主要是微生物可以产生各种酶类，在酶的作用下可将毒素降解成为其他毒性小或者无毒的代谢物，但是微生物种类繁多，起到降解ZEN毒素作用的是何种酶、降解产物是什么都有待于进一步研究。

对ZEN降解机制研究比较透彻的是粉红粘帚霉（C.roseaIFO7063）菌株的降解机制。Kakeya H等［21］对分离到粉红粘帚霉（C.roseaIFO7063）菌株进行了研究，研究发现该菌株可将ZEN转化为1－（3，5－二羟苯基）－10′－羟基－1′反式十一碳烯－6′－酮，该降解产物无任何雌激素活性。Takahashi－Ando N等［22］对该菌株降解ZEN机制做了进一步研究，发现是该菌株分泌的一种水解酶起到降解作用，他纯化出了该降解ZEN毒素的水解酶并克隆出编码该蛋白的基因，命名为zhd101。随后，zhd101基因被成功克隆到大肠埃希菌（E.coli）和酿酒酵母（S.cerevisae）中，导入该片段基因的大肠埃希菌在24h内 可 将 培 养 基 中 的 ZEN、α－zearalenol 和 βzearalenol降 解成为 无 毒 产 物［23］。Utermark J等［24］通过插入潮霉素抗性基因使能够降解ZEN毒素的粉红黏帚霉菌株（G.roseum）zes2基因失活，zes2基因失活的G.roseum菌株不能水解ZEN的内酯键，变得对ZEN敏感，该试验证明了G.roseum菌株zes2基因编码的内酯酶是降解ZEN的功能性蛋白质。Yu Y等［13］对能够降解ZEN毒素的SM04菌株降解机制进行了研究，采用HPLC、APCI－MS分析方法测定SM04菌株与ZEN作用12h之后ZEN及其代谢产物，结果表明在12h之后没有发现ZEN，MTT细胞增殖法确定代谢产物无雌激素活性，但没有确定最终降解产物分子结构式。采用MALDI－TOF－TOF／MS分析法确定了与ZEN降解有关的酶，但由于缺少不动杆属细菌分泌相关酶的资料，还需进一步研究确定降解酶的性质。Abdulla D A 等［14］对恶臭假单胞菌（Pseudomonasputida）参与ZEN起始反应降解反应酶的基因特性进行了研究，克隆了一个5.5kb的PstⅠ－KpnⅠ的片段，该片段编码玉米赤霉烯酮降解酶，克隆的基因在大肠埃希菌中进行了活性表达，重组大肠埃希菌降解玉米赤霉烯酮表现的迅速有效，24h后没有玉米赤霉烯酮残留，但降解产物是何种化合物没有确定。Vekiru E等［25］使用液相色谱质谱联用法和液相色谱－二极管阵列检测分析法最终鉴定了在毛孢子菌属T.mycotoxinivorans菌株作用下ZEN毒素的降解产物，命名为ZOM－1，采用飞行时间质谱法确定了ZOM－1的分子式C18H24O7，最终经过核磁共振波谱法确定其化学结构式为5S－5－｛［2，4－二羟基－6－（1E－5－羟基戊－1－烯－1－基）苯甲酰］氧基｝己酸。体内外试验证明该降解产物完全无雌激素作用。

由此可见，ZEN毒素通过不同的降解菌株作用后，降解产物不同，各种降解菌的降解能力不同，不同降解菌分泌的降解酶不同，降解酶的编码基因不同。因此，对ZEN毒素的各种降解菌株的降解机制需更加深入的研究。

3 展望

由于玉米赤霉烯酮污染的严重性、广泛性及危害的严重程度，许多国家对ZEN的研究从未间断过，尤其对其生物降解方面的研究。近年来研究进展很快，未来通过生物工程减少ZEN的危害将成为研究热点。主要应集中在以下几个研究方向：①利用微生物基因工程，将ZEN水解酶基因（如zhd 101）转化大肠埃希菌、酵母或其他模式微生物，大量生产ZEN水解酶，应用于受镰刀霉污染的玉米和其他粮食的脱毒；或直接用有益微生物如乳酸杆菌表达系统表达降解酶基因，用于饲料直接饲喂家畜，使其在动物胃肠道降解饲料中的ZEN。②提高ZEN降解酶基因表达水平，构建新的表达系统，提高降解酶基因的表达量及其活性。③发现新的ZEN降解酶基因，发现新的降解酶基因有赖于分离鉴定出新的能够降解ZEN的菌株。

玉米赤霉烯酮的生物降解技术研究尚存在许多不足之处，如对降解的机理缺乏研究，并且研究的不够深入、菌种存在降解能力不稳定和退化等问题。由于生物降解玉米赤霉烯酮既不会有毒素残留，也不会有不良的副产物出现，同时容易大规模操作等优点而具有广阔的应用前景。

［1］计 成，赵 红.黄曲霉毒素生物降解的研究及前景展望［J］.动物营养学报，2010（2）：241－245.

［2］Zinedine A，Soriano J M，MoltóJ C，et al.Review on the toxicity，occurrence，metabolism，detoxification，regulations and intake of zearalenone：An oestrogenic mycotoxin［J］.Food Chem Toxicol，2007，45：1－18.

［3］梁梓森，刘长永，马勇江，等.玉米赤霉烯酮对小鼠血常规及血液生化指标的影响［J］.动物医学进展，2010，31（5）：79－82.

［4］龙 淼，张乃生，朱连勤，等.霉菌毒素对奶牛健康的影响［J］.饲料工业，2008，29（17）：38－40.

［5］邓友田，袁 慧.玉米赤霉烯酮毒性机理研究进展［J］.动物医学进展2007，28（2）：89－92.

［6］Jouany J P.Methods for preventing，decontaminating and minimizing the toxicity of mycotoxins in feeds［J］.Anim Feed Sci Technol，2007，137（3－4）：342－362.

［7］单 妹，许梓荣，冯建蕾.饲料中霉菌毒素脱毒方法的研究进展［J］.饲料研究，2005（11）：40－42.

［8］熊凯华，程波财，胡威，等.玉米赤霉烯酮降解的研究进展［J］.中国粮报，2010，25（10）：138－142.

［9］Megharaj M，Garthwaite I，Thiele J H.Total biodegradation of the oestrogenic mycotoxin zearalenone by a bacterial culture［J］.Lett Appl Microbiol，1997 24（5）：329－333.

［10］El－deeb B A，Altalhi A.Isolation and characterisation of soil bacteria able to degrade zearalenone［J］.Am J Bot，2005，32：3－30.

［11］El－Nezami H，Polychronaki N，Salminen S，et al.Binding rather than metabolism may explain the interaction of two foodgradeLactobacillusstrains with zearalenone［J］.Appl Environ Microbiol，2002，68（7）：3545－3549.

［12］Cho K J，Kang W T，Cho C H，et al.Invitrodegradation of zearalenone byBacillussubtilis［J］.Biotechnol Lett，2010，32：1921－1924.

［13］Yu Y，Qiu L，Wu H ，et al.Degradation of zearalenone by the extracellular extracts ofAcinetobactersp.SM04liquid cultures［J］.Biodegradation，2010，11：1－10.

［14］Abdulla D A.Localization of zearalenone detoxification gene（s）in pzea－1plasmid of pseudomonas putida zea－1and expressed inEscherichiacoli［J］.J Hazardous Materials.2009，161：1166－1172.

［15］Tinyiro S E，Wokadala C，Xu D，et al.Adsorption and degradation of zearalenonebyBacillusstrains［J］.Folia Microbiol，2011，56（4）：321－327.

［16］Tinyiro S E，Yao W，Sun X，et al.Scavenging of zearalenone byBacillusstrainsinvitro［J］.Res J Microbiol，2011，6：304－309.

［17］程波财，姜淑英，汪孟娟，等.藤黄微球菌降解真菌毒素玉米赤霉烯酮的研究［J］.中国微生态学杂志，2010，22（5）：389－392.

［18］Molnar O，Schatzmayr G，Fuchs E，et al.Trichosporonmycotoxinivoranssp.nov.，A new yeast species useful in biological detoxification of various mycotoxins［J］.System Appl Microbiol，2004，27（6）：661－671.

［19］Bakutis B，Baliukoniene V，Paskevicius A.Use of biological method for detoxification of mycotoxins ［J］.Botanical Lithuanica，2005，7：123－129.

［20］吴 晖，冼嘉雯，刘冬梅.一株去除玉米赤霉烯酮酵母的初步研究［J］.食品工业科技，2009，30（12）：215－216.

［21］Kakeya H，Takahashi－Ando N，Kimura M，et al.Biotransformation of the mycotoxin，zearalenone，to a non－esrtogenic compound by a fungal strain ofClonostachyssp［J］.Bioscience Biotechnol Biochem，2002，66（12）：2723－2726.

［22］Takahashi－Ando N，Kimura M，Kakeya H ，et al.A novel lactonohyrolase responsible for the detoxification of zearalenone：enzyme purification and gene clong［J］.Biochem J，2002，365：1－6.

［23］Takahashi－Ando N，Ohsato S，Shibata T，et al.Metabolism of zearalenone by genetically modified organisms expressing the detoxification gene from clonostachys rosea［J］.Appl Environ Microbiol，2004，70（6）：3239－3245.

［24］Utermark J，Karlovsky P.Role of zearalenone lactonase in protection of gliocladium roseum from fungitoxic effects of the mycotoxin zearalenone［J］.Appl Environ Microbiol，2007，73（2）：637－642.

［25］Vekiru E，Hametner C，Mitterbauer R，et al.Cleavage of zearalenone by trichosporon mycotoxinivorans to a novel nonestrogenic metabolite［J］.Appl Environ Microbiol，2010，4：2353－2359.