于志君，朱晓文，刘 红，李 硕，范宝静，王世申，吴 静，武艳丽，王铁成，杨松涛，黄 耕，高玉伟，夏咸柱＊

（1.吉林大学畜牧兽医学院，吉林 长春 130062；2.中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所，吉林省人畜共患病预防与控制重点实验室，吉林 长春 130122；3.长春市疾病预防控制中心，吉林 长春 130033）

A型流感病毒（Influenza A virus）在我国亦称甲型流感病毒，属于正黏病毒科（Orthomyxoviridae），是单股负链RNA病毒[1]。该病毒的基因组由8条分节段的RNA片段组成，共编码11种蛋白[1]。根据病毒血凝素（haemagglutinin，HA）和神经氨酸酶（neuraminidase，NA）抗原性的不同，A型流感病毒被分为16种HA亚型和9种NA亚型[1]。雁形目（Anseriformes）和鸻形目（Charadriformes，如海鸥和岸禽）的水禽是A型流感病毒的自然宿主[2－3]，目前已知的A型流感病毒所有亚型均能从鸟类体内分离出来[3]。

历史上共发生过4次流感大流行，分别是1918年的西班牙流感、1957年的亚洲流感、1968年的香港流感和2009年的甲型H1N1流感。2009年甲型H1N1流感疫情的暴发改变了人们之前对流感大流行的认识，以往人们普遍认为下一次流感大流行一定是由一种新的亚型流感病毒引起。迄今为止，包括2009年甲型H1N1流感大流行在内的所有流感大流行均是由A型流感病毒引起，因此研究A型流感病毒致病性机制可以为人们制定流感病毒防控和治疗策略提供参考。另外，自从1997年香港首次报道人类感染H5N1亚型高致病性禽流感病毒后，动物流感病毒跨越种属障碍感染人的事件便时有发生，对公共卫生安全构成严重威胁，引起人们对A型流感病毒跨种传播的关注。目前研究发现，A型流感病毒的跨种传播和致病性主要受聚合酶蛋白、血凝素蛋白影响，因此本文将讨论的焦点主要集中在以上两种蛋白上，另外非结构蛋白1和PB1－F2蛋白对流感病毒的致病性也有一定的影响。

1 聚合酶蛋白

1.1 对流感病毒跨种传播的影响

1.1.1 调控病毒的温度敏感性 若流感病毒PB2蛋白第627位氨基酸为赖氨酸（K），则该毒株可以在哺乳动物上呼吸道内有效复制，若PB2蛋白第627位氨基酸为谷氨酸（E），则该毒株不能在哺乳动物上呼吸道内有效复制[4]。体外试验证明，PB2－E627K突变在温度为33℃时可以增强病毒在哺乳动物细胞上的复制能力，但37℃和41℃时则不能[5]。从这些试验结果来看，流感病毒可以通过聚合酶蛋白上氨基酸突变来改变毒株的温度敏感性，调控A型流感病毒的跨种传播。

1.1.2 调控入核转运 研究人员采用基因沉默技术发现入核转运蛋白α与流感病毒的复制有关[6－8]。入核转运蛋白α主要与流感病毒的聚合酶蛋白进行结合，介导该类蛋白的入核转运过程。研究者在研究一株名为SC35M的流感病毒鼠适应株时发现，该病毒的PB2－D701N突变和NP－N319K突变可以显著增强病毒蛋白与哺乳动物细胞的入核转运蛋白α1之间的结合能力。另外，有研究表明PB2－D701N突变也可以通过促进PB2聚合酶蛋白上核定位信号的暴露来增加病毒PB2蛋白与入核转运蛋白α之间的结合[9]。研究表明，流感病毒聚合酶蛋白对入核转运过程的适应可能在流感病毒跨种传播过程中扮演了重要的角色[10]。

1.2 对流感病毒致病性的影响

流感病毒聚合酶蛋白可以通过直接影响病毒的复制效率来改变病毒的致病性。研究者在研究一株名为SC35的H7N7亚型高致病性禽流感病毒时发现，该病毒对小鼠致病力的强弱受病毒PB2蛋白调控[11]。研究者将SC35适应小鼠后得到SC35鼠适应株（SC35M），测序和序列比对后发现，SC35M病毒蛋白上的多个氨基酸位点发生置换，为了鉴定出与病毒致病性增强有关的氨基酸置换，研究者采用反向遗传技术拯救出具有不同氨基酸置换位点的SC35流感病毒并对其生物学特性进行研究，结果发现，与SC35母本毒株相比，发生PB2－D701N、PB2－S714R和PA－K615N氨基酸置换的流感病毒在哺乳动物细胞上的复制效率显著提高，而在禽类细胞上的复制效率则显著下降，并且具有上述氨基酸置换的流感病毒对小鼠的致病性也显著增强，因此，研究者认为，该病毒的聚合酶蛋白通过影响病毒的复制效率来改变病毒的致病性。流感病毒PB2－D701N突变还会影响病毒的传播性。研究者在研究一株名为DKGX／35的H5N1亚型禽流感病毒时发现该毒株PB2蛋白第701位氨基酸为谷氨酰胺（N）是该病毒能够在豚鼠间进行有效传播的前提条件[12]。除了PB2－D701N 突变外，PB2－E627K突变也与流感病毒的致病性密切相关[13－14]。通常情况下，禽流感病毒PB2蛋白第627位为谷氨酸（E），而人流感病毒为赖氨酸（K）。研究证实，H5N1亚型禽流感病毒PB2蛋白上第627位氨基酸若为谷氨酸（E），则该毒株对哺乳动物无致病性，但如果该位点为赖氨酸，则毒株接种小鼠后可以引起小鼠全身性感染并导致小鼠发病死亡[13]。研究者发现禽流感病毒在小鼠身上传一代即可获得PB2－E627K突变[4，15]，而一些从人类感染者体内分离出的 H5N1亚型禽流感病毒也具备 PB2－E627K 突变[16－17]，这些发现都表明PB2－E627K突变与流感病毒致病力的改变密切相关。另外，流感病毒PB2－E627K突变也会影响病毒的传播性[18]。

测序发现甲型H1N1流感病毒PB2蛋白第627位和第701位氨基酸残基都为“禽型”氨基酸（PB2－701D，PB2－627E）[19]，为了证明这是否是导致该病毒对人致病性较弱的原因，研究者通过反向遗传技术在这两个位点上引入PB2－E627K突变和PB2－D701N突变，但结果发现突变后的流感病毒对小鼠和雪貂的致病性均未增强[20]，说明这两个氨基酸位点不能影响甲流病毒对哺乳动物的致病性。近来经证实，PA－E298K突变可以显著增强甲型H1N1流感病毒对小鼠的致病力[21]，不过该氨基酸位点是否是甲型H1N1流感病毒惟一的毒力决定子尚有待进一步研究。

2 血凝素

2.1 对流感病毒跨种传播的影响

由于不同宿主细胞表面的受体类型存在差异，因此某种流感病毒能够感染的宿主范围受病毒血凝素受体结合特异性调控[22]。人流感病毒具有α2，6交联唾液酸受体结合特异性（又称“人型”受体结合特异性），因此易感染分布有α2，6交联唾液酸受体的人呼吸道上皮细胞，而禽流感病则具有α2，3交联唾液酸受体结合特异性（又称“禽型”受体结合特异性），因此易感染分布有α2，3交联唾液酸受体的禽肠道上皮细胞[23－25]。对于不同亚型流感病毒而言，其血凝素蛋白上调控受体结合特异性的氨基酸位点并不相同。对H1亚型流感病毒而言，若其血凝素第190位（文中出现的血凝素上氨基酸位点的位置均相对于H3亚型流感病毒而言）和第225位氨基酸残基为天冬氨酸（D），则该毒株具有“人型”受体结合特异性，若其血凝素第190位氨基酸残基为谷氨酸（E）、第225位氨基酸残基为甘氨酸（G），则该毒株具有“禽型”受体结合特异性；对H2、H3亚型流感病毒而言，若其血凝素第226位氨基酸残基为亮氨酸（L）、第228位氨基酸残基为丝氨酸（S），则该毒株具有“人型”受体结合特异性；若其血凝素第226位氨基酸残基为谷氨酰胺（N）、第228位氨基酸残基为甘氨酸（G），则该毒株具有“禽型”受体结合特异性[26]。

目前，科学家们已经采用糖芯片（carbohydrate microarrays）技术研究了甲型H1N1流感病毒的受体特异性。其中一项研究结果显示该病毒只能够与α2－6交联唾液酸序列结合[27]，然而另外一项采用了其他糖芯片进行研究的试验结果则显示该病毒也能够与包含α2－3交联唾液酸序列的探针结合，但仍以α2－6交联唾液酸受体特异性为主。因此，流感病毒大流行株对血凝素受体结合特异性的要求并没有大的改变，即流感病毒仍然需要具有“人型”受体结合特异性才能在人群中引发流感疫情。

近年来，H5N1亚型流感病毒跨种传播感染人的事件频频发生，死亡率接近60%。但从这些患者体内分离出的H5N1亚型流感病毒的受体结合特性没有发生任何改变，即仍偏向于结合α2，3受体（“禽”型受体）[13]。另外，尽管 H5N1亚型流感病毒的致死率较高，但该亚型病毒并不能在感染者与接触者之间进行有效传播，以上两点再一次证明流感病毒需要具有“人型”受体结合特异性才能在人群中进行有效地传播。

2.2 对流感病毒致病性的影响

血凝素蛋白水解酶活性是流感病毒的一个主要毒力决定子。因为只有血凝素前体H0被宿主体内存在的蛋白水解酶裂解为HA1和HA2而暴露出HA2氨基端的融合肽后，病毒囊膜才能与宿主细胞膜进行融合，感染宿主细胞。高致病性禽流感病毒（HPAIV）对禽类的高致病性与其血凝素前体H0的高蛋白水解酶活性密切相关[28]。对于低致病性禽流感病毒（LPAIV），其血凝素裂解位点处只有一个精氨酸（R），只能被宿主类胰蛋白酶裂解，而这类酶只分布在少数几个脏器中，故限制了病毒对组织脏器的感染；而高致病性禽流感病毒则不同，它们的血凝素前体H0的裂解位点处为多个碱性氨基酸，可以被多种酶类（如弗林蛋白酶和PC6蛋白酶）裂解。不过目前人们只在高致病性禽流感病毒中发现多碱性裂解位点，尚没有从人群中分离出血凝素上带有多碱性裂解位点的人流感病毒。

3 非结构蛋白1（NS1）对流感病毒致病性的影响

A型流感病毒的致病性与其逃避机体免疫应答的能力密切相关，而非结构蛋白1（NS1）在病毒逃避机体免疫的过程中起着重要的作用。NS1蛋白最重要的功能是颉颃干扰素（IFN）。NS1蛋白主要通过两种途径来发挥干扰素颉颃剂功能以消除机体对流感病毒的免疫应答：①通过NS1蛋白与双链RNA的结合来抑制I型干扰素激活物——双链RNA激活蛋白激酶（double－stranded RNA－activated protein kinase）的活化；②NS1蛋白可以通过阻止流感病毒的病原体相关分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMPs）识别类维生素A诱导基因1（retinoid inducible gene－1，RIG－1）等途径，抑制刺激干扰素合成的转录因子的活化。

NS1蛋白上的某些氨基酸残基与流感病毒的毒力密切相关。如果H5N1亚型高致病性禽流感病毒NS1蛋白第92位氨基酸是谷氨酸（E），则该毒株对小鼠有致病性，如果是天冬氨酸（D），则对小鼠无致病性。体外试验证明，如果NS1蛋白第92位氨基酸是谷氨酸（E），则该毒株可以在存在干扰素的细胞上复制，并且对猪有致病性。同样，当一株H5N1亚型禽流感病毒NS1蛋白上发生NS1－P42S突变后，该毒株对小鼠的毒力显著增强，并且在体外试验中该突变株可以减少α干扰素和β干扰素的产量。在体外试验中发现，H5N1亚型禽流感病毒的NS1蛋白上若发生NS1－L103F 和 NS1－I106M突变，则NS1蛋白与细胞前体mRNA加工处理蛋白－切割及多聚腺苷酸化特异性因子30（cleavage and polyadenylation specificity factor 30，CPSF30）的结合能力增强，同时病毒的复制能力也显著增强，研究者由此推断流感病毒能够通过NS1蛋白来抑制α干扰素和β干扰素前体mRNA的表达，从而提高病毒在宿主体内的复制能力。

有研究显示，尽管甲型H1N1亚型流感病毒能够抑制干扰素的表达，但是该病毒的NS1蛋白却不能与CPSF30结合[29]。然而，将甲型H1N1亚型流感病毒NS1蛋白108、125和189三处位点上的氨基酸突变成其他人流感病毒在相同位点处所共有的保守氨基酸后，变异株对小鼠和雪貂的毒力减弱，表明该病毒的NS1蛋白可以调控其毒力，因此研究NS1蛋白的生物学活性可能有助于我们探究A型流感病毒致病性的分子机制。

另外，NS1蛋白的羧基端也会影响流感病毒的致病性，但具体机制尚待研究。1918年西班牙流感病毒和H5N1亚型高致病性禽流感病毒的羧基端都有一段由4个羧基端氨基酸组成PDZ配体区，当把这个PDZ配体区引入到鼠适应性流感毒株后，可以增强鼠适应株对小鼠的毒力。虽然我们尚不知道NS1蛋白PDZ配体区的致病机制，但是这个PDZ配体区应该与NS1蛋白的抗干扰素作用无关。

4 PB1－F2蛋白对流感病毒致病性的影响

PB1－F2蛋白是由PB1基因＋1读码框编码的小蛋白，共有90个氨基酸。PB1－F2蛋白具有调控流感病毒感染早期的病毒毒力和诱导继发性细菌感染的功能。PB1－F2蛋白能够和线粒体的电依赖阴离子通道1（VDAC－1）及腺嘌呤核苷酸转运蛋白3（ANT3）相互作用，破坏细胞线粒体，促进免疫细胞凋亡。有研究发现，当1918年西班牙流感病毒和H5N1亚型高致病性禽流感病毒PB1－F2蛋白上发生PB1－F2－S66N突变后，这两株毒株对小鼠的毒力减弱，而当发生N66S突变时，病毒对小鼠的致病性则显著增强。甲型H1N1流感病毒的PB1－F2蛋白由11个氨基酸组成，缺失了一段氨基酸。而且不论是引入 PB1－F2－66N 还是 PB1－F2－66S，甲型 H1N1亚型流感病毒对小鼠及雪貂的毒力都没有明显增强，也不会使小鼠更易出现由肺炎链球菌介导的继发性细菌感染[30]。

5 小结

A型流感病毒每年都在发生变异，对公共安全构成严重危害，因此，研究A型流感病毒跨种传播和致病性的分子机制可以为防控流感疫情提供理论基础。目前的研究发现该型病毒的跨种传播和致病性主要受病毒的聚合酶蛋白、血凝素蛋白和非结构蛋白影响，但病毒的其他蛋白是否也对病毒有影响还在进一步的研究中。另外，虽然目前甲型流感疫情已经过去，但有证据表明甲型H1N1亚型流感病毒的聚合酶蛋白和NS1蛋白并没有充分适应人类宿主，这表明该病毒的流行性和潜在致病性可能还没有被完全耗尽，而且根据以往流感病毒的流行规律，甲型H1N1流感病毒还会在人群中循环相当长一段时间，不能排除该病毒通过长时间抗原漂移或基因重组而产生毒力和传播性更强的变异株的可能，因此应继续对已出现的流感毒株进行分析，并深入研究影响A型流感病毒跨种传播和致病性的病毒蛋白，为预测具有潜在流行性的毒株奠定基础。

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