汪林宝 赵 松 (郑州大学第一附属医院,河南 郑州 450052)

MicroRNA(miRNA)是近年来被发现的在自然界生物体中广泛存在的大小 21～23 nt的一类非编码小分子 RNA〔1,2〕,在转录后水平对编码蛋白的 mRNA进行调控,抑制基因表达〔3〕。尽管 miRNA的生物学作用及调控的目标基因还没有完全清楚,但它在细胞分化、增殖、死亡等复杂的生物学过程中的调控作用已经得到证实〔4〕。特别是 miRNA家族中的 let-7在人类肺癌、结肠癌、胃癌、乳腺癌中低表达表明它作为抑癌miRNA参与肿瘤的发生发展,并且在某些肿瘤中抑制癌基因 Ras和c-myc的表达〔5～9〕。

目前对miRNA进行检测的主要方法有RT-PCR、Northern印迹、cDNA arrays,它们有各自的优缺点,miRNA前体同miRNA成熟体的表达水平基本上是一致的〔10〕。本研究采用RTPCR法对let-7a-1前体和 K-ras在食管癌及正常食管黏膜中进行半定量检测,初步探讨其在食管癌发生、发展过程中的作用,为食管癌的诊断、基因治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 标本收集及处理 收集 2010年 7月郑州大学第一附属医院胸外科手术切除的新鲜食管癌标本 20例,标本离体30min内分离切端正常食管黏膜(距肿块边缘＞5cm)及癌组织,置入冻存管中液氮迅速冷冻后,放入 -80℃冰箱中保存。经病理证实 20例癌组织中 17例为鳞癌,3例为腺癌。所有食管癌患者术前均未接受化疗、放疗。其中男 13例,女 7例;年龄 47～83〔平均(63.30±8.66)〕岁;中分化 16例,高分化 4例;有淋巴结转移 7例,无淋巴结转移 13例;肿瘤分期(食管癌国际 TNM分期标准第 7版):Ⅰ期 1例,Ⅱ期 14例,Ⅲ期 5例。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取 每份标本取约 0.1 g,充分研磨后,加入 Trizol试剂(Invitrogen公司)和三氯甲烷提取 RNA,异丙醇沉淀,75%乙醇洗涤,干燥后溶入 20～30μl焦碳酸二乙酯水溶液中,所得的总 RNA用分光光度计测定其浓度和纯度。……