幽门螺杆菌感染致慢性荨麻疹诱发或加重的机制探讨

2011-03-30李彦希

实用皮肤病学杂志 2011年1期

吕静，李彦希，薛梅，柯丹

吕静，李彦希，薛梅，柯丹

目的观察幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, Hp）感染的BALB/c小鼠模型外周血及胃黏膜组胺和类胰蛋白酶的变化，以探讨Hp在诱发慢性荨麻疹（CU）或使病情加重过程中的机制。方法 90只健康BALB/c小鼠随机分成3组（实验1组、实验2组和对照组），每组各30只。实验1、2两组分别灌胃高毒力株（VacA+ CagA+）和低毒力株（VacA- CagA+）Hp菌悬液，对照组灌胃牛血清白蛋白（BAS）。分别采用组胺荧光测定法、类胰蛋白酶免疫组化法及ELISA法检测三组标本灌胃前后外周血、胃黏膜组胺和类胰蛋白酶含量。结果实验1、2组小鼠外周血及胃黏膜组胺含量均高于对照组（P＜0.01），实验1、2两组小鼠外周血组胺含量无显著性差异（P＞0.01），但实验1组小鼠胃黏膜内组胺含量低于实验2组（P＜0.01）；实验1、2两组小鼠外周血及胃黏膜类胰蛋白酶含量均高于对照组（P＜0.01），实验1组小鼠胃黏膜类胰蛋白酶含量低于实验2组（P＜0.01），但外周血类胰蛋白酶含量高于实验2组（P＜0.01）。结论 Hp感染可导致小鼠模型外周血及胃黏膜组胺和类胰蛋白酶含量均增加，这可能是Hp诱发或加重CU的重要原因之一。

幽门螺杆菌；慢性荨麻疹；毒力；组胺；类胰蛋白酶

[J Pract Dermatol, 2011, 4(1):12-15]

慢性荨麻疹（chronic urticaria，CU）是皮肤科常见的变态反应性疾病，严重影响患者生活质量，症状的产生主要为肥大细胞和嗜碱性粒细胞活化后释放组胺、蛋白水解酶、合成和分泌化学介质、细胞因子所引起。近年来，幽门螺杆菌（helicobacter pylori，Hp）感染与慢性荨麻疹的关系逐渐被研究人员所认识，肥大细胞脱颗粒导致皮肤、粘膜小血管扩张和通透性增加是荨麻疹发生的关键，而Hp感染可能导致肥大细胞脱颗粒的增加从而诱发或加重性慢性荨麻疹[1]。但目前对Hp感染后肥大细胞脱颗粒的量化测定尚无相关文献报道，故本研究拟从肥大细胞脱颗粒的标志物组胺和类胰蛋白酶入手，采用免疫荧光、免疫组化、ELISA等方法来测定二者在Hp感染的小鼠模型外周血及胃黏膜的含量，从而定量的判断Hp感染后肥大细胞脱颗粒的情况，从发病机制的角度进一步探讨Hp感染诱发或加重CU的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物清洁级BALB/c小鼠90只，6～8周龄，体重17～20g，雌雄各半。饲养于重庆医科大学微生物教研室动物房，清洁喂养。随机分成实验1组、实验2组和对照组，每组30只。

1.1.2 菌株采用重庆医科大学病原微生物实验室分离培养的高毒力Hp菌株 NC11637（VacA+ CagA+，空泡毒素阳性菌株）和低毒力Hp菌株NC11638（VacACagA+，空泡毒素阴性菌株）。Hp菌株经Hpylori选择性培养基纯培养3天后，用PH7.0的布氏肉汤洗涤，麦氏比浊管比色，调整菌液浓度为2×109cfu/ ml，采用脑心浸液加甘油制成的冷冻保存液置于-70℃低温保存，备用。

1.1.3 主要试验仪器及试剂 RF-540型荧光分光光度计（日本岛津仪器公司），光学显微镜、光学显微镜照相系统（日本Olympus公司），96孔酶标板（Falcon公司）。Helico Blot试剂盒（新加坡Genelabs Diagnostics公司），Hp-Ab检测试剂盒（上海天呈科技有限公司），鼠抗单克隆抗体（福建迈新公司），小鼠抗人类胰蛋白酶抗体由重庆医科大学免疫实验室惠赠。三羟甲基氨基甲烷（Tris），NaCl，牛血清白蛋白（BSA），叠氮钠（NaN3），Hepes，EDTA. Na2，二乙醇胺（DEA），氯化镁，对硝基苯磷酸（pNPP），连接链霉亲和素的碱性磷酸酶（strepavidinalkalinephosphatase，SAV-AP）等试剂均购自上海生工公司。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制备每组实验动物各30只。实验前，1、2组小鼠禁食24h，3% NaHCO30.2ml中和胃酸，分别以2×109CFU/ml的高毒力（VacA+ CagA+）和低毒力（VacA- CagA+）Hp菌悬液0.5ml灌胃，4h后恢复食水供给。上述操作每3日重复一次，共7次。对照组以2% BAS溶液0.5ml灌胃，操作方式同上。末次灌喂后10天检测小鼠外周血的抗-Hp抗体和快速尿酶实验，同时进行胃黏膜细菌培养，结果显示实验1、2组中各有24只模型制作成功，感染率为80%。

1.2.2 标本采集末次灌胃后第10天，小鼠处死前抽取0.5ml肝素抗凝全血两份，一份用于组胺荧光测定，一份用于类胰蛋白酶ELISA法测定。颈椎脱位法将小鼠全部处死，于无菌超净台中取出胃组织，用灭菌生理盐水清洗胃中内容物，沿胃大弯将胃黏膜纵切四等份，分别用于胃黏膜Hp培养、快速尿素酶实验、组胺荧光测定和类胰蛋白酶免疫组化测定。

1.2.3 外周血及胃黏膜组胺含量测定根据向军俭[2]微量组胺荧光测定法，用RF-540型荧光分光光度计在激发波长360nm、荧光波长450nm下测定荧光强度，根据荧光强度算出外周血及胃粘膜组胺含量（测定组胺的工作曲线回归方程为F=1.579C+37.622，相关系数r=0.9995，线性范围为1.01×10-9～9.01 ×10-7ug/L-1，检出限为4.51×10-9mol/L，回收率为92.9%～112.5%）。

1.2.4 外周血及胃黏膜样本类胰蛋白酶含量测定取10%甲醛固定的胃黏膜组织，经石蜡包埋、切片后进行HE染色和免疫组化超敏SP法作MCT染色。后者一抗为鼠抗单克隆抗体，操作步骤按试剂盒说明书进行。试剂盒中随带的对照片为阳性对照，PBS替代一抗作阴性对照。MCT染色片在BI-2000医学图像分析系统上分析，随机取l0个视野进行MCT阳性颗粒的平均计数。采用陆超等[3]所建立的类胰蛋白酶ELISA检测方法对血样本中的类胰蛋白酶进行检测：将抗人类胰蛋白酶抗体B12加入包被液中混匀，每孔加100μl，4℃过夜。用封阻液（0.01mol/I Tris，1.0mol/L NaC1，0.1%BSA，0.1% NaN，PH 8.5）封阻30 min．再用封阻液清洗3次，每次15 min，最后蒸馏水清洗3次。标准品用稀释液（0.01mol/L Hepes，0.5mol/L NaCl，25 mmol/L EDTA.Na2，0.1% BSA，0.05% NaN3，PH7.4）稀释至所需浓度（0.1、0.3、0.6、1.0、3.0、6.0、10 ng/ ml），用稀释液按1∶4稀释血清标本，样品与标准品均100μl/孔加样，作3复孔，4℃ 过夜。洗板同上。每孔加100μl溶于稀释液的生物素化第二抗体G3，浓度500 ng/ml，4℃ 放置2 h。洗板同上。SAV-AP与稀释液以1∶2000稀释，100μl/孔，常温放置1h。洗板同上。加显色液（1mol/L DEA，0.01% MgCl2，0.1%NaN3，PH 9.8）100μl/孔，临用前加入pNPP使其终浓度为10 mg/ml，37℃ 温育。分别在15 min、45 min、1 h读数。

1.2.5 统计学分析

2 结果

2.1 外周血及胃黏膜中组胺含量比较

实验1、2组小鼠胃黏膜内及外周血中组胺含量均较对照组升高，差异均有统计学意义（P＜0.01）；实验1组小鼠胃黏膜内组胺含量低于实验2组，差异有统计学意义（P＜0.01），但外周血组胺含量无显著性差异（P＞0.01）（表1）。

表1 外周血及胃黏膜组胺含量测定结果（±s）

组别 n 血组胺（ug/L-1）胃粘膜组胺（ug/g-1）实验1组 24 80.44±10.15 12.50±2.44实验2组 24 79.28±12.02 16.66±4.41对照BAS组 30 56.43±9.88 7.89±1.24

2.2 外周血及胃黏膜中类胰蛋白酶含量比较

实验1、2两组小鼠外周血及胃黏膜中类胰蛋白酶含量均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）；实验1组外周血类胰蛋白酶含量高于实验2组，但胃黏膜类胰蛋白酶含量低于后者，差异均具有统计学意义（P＜0.01）（表2）。

表2 外周血及胃黏膜类胰蛋白酶含量测定结果（±s）

组别 n 血类胰蛋白酶（ng/ml）胃MCT（个/10视野）实验1组 24 2.08±1.12 21.33±3.25实验2组 24 1.41±0.98 30.98±3.90对照BAS组 30 0.45±1.32 9.56±2.89

3 讨论

研究发现，Hp感染与诱发CU或加重其临床症状的原因可能与以下因素有关：①Hp可诱导肥大细胞和嗜碱性粒细胞组胺等活性物质的释放；②Hp局部的定植及由此引起的慢性炎症参与了全身性免疫过程，通过产生各种介质和细胞因子放大皮肤炎症反应；③Hp感染使胃肠黏膜屏障受到破坏，致进入肠道的抗原或其他促炎症因子更易吸收并暴露于免疫系统而诱发或加重慢性荨麻疹，且确有部分Hp抗体阳性的CU患者经抗Hp治疗后，其CU的病情得到改善[4]。前期研究显示Hp感染可能是诱发CU或加重的诱因[5]，故我们通过检测Hp感染后小鼠模型胃黏膜肥大细胞脱颗粒的情况来进一步佐证二者之间的关系。

文献报道人群中Hp的感染率为50%左右，CU患者合并Hp感染的几率较高，但并非所有感染了Hp的患者都会出现慢性荨麻疹的症状，这种现象可能是由于Hp菌株的不同和毒力大小差异引起[6]。细胞空泡毒力（vaculatingcytotoxin，VacA）是Hp的主要毒力因子[7]，而其在CU中的作用目前国内外研究很少。在本研究中我们选取了高毒力（VacA+ CagA+）和低毒力（VacA- CagA+）Hp菌株，探讨细胞空泡毒力不同Hp菌株对动物模型胃粘膜肥大细胞（mast cell，MC）脱颗粒的影响，从而探讨Hp感染后CU的发生与否或病情的严重程度与Hp的分型是否存在一定关系。我们的前期研究曾发现Hp（VacA+ CagA+）感染小鼠模型胃粘膜内MC总数、脱颗粒MC总数及脱颗粒MC百分比均明显高于对照组，镜下可见胃粘膜内MC成群、成团分布，胞膜破溃，颗粒涌出胞膜，成喷射状泻出，且有大量淋巴细胞、单核细胞等炎症细胞浸润[8]。徐克强等[9]研究发现Hp感染后胃粘膜中脱颗粒的MC较Hp阴性者明显增加。国内相关动物实验也表明，Hp菌株粗提抗原注入SD大鼠胃壁后可显著刺激MC的脱颗粒数，从而释放组胺和一系列血管活性介质，引起粘膜血管的扩张及粘膜的疾病。

在本研究中我们观察到，两组实验组小鼠胃黏膜内及外周血中组胺含量升高，高毒力株所致的胃黏膜组胺含量低于低毒力株，与卢杰夫等[10]的研究结果有一定差异，他们发现Hp感染患者胃黏膜组胺含量较Hp阴性者降低，而外周血中组胺含量则高于Hp阴性者。分析本试验中两组实验组小鼠外周血组胺含量差异不明显，可能与组胺代谢速度快，通常在1～2min就被甲基转移酶和联胺氧化酶快速代谢有关[11,12]，故在外周血中未检测到较高的组胺含量。活化的肥大细胞分泌颗粒中除组胺外，还包括一些蛋白水解酶，比如类胰蛋白酶，以往的研究大多是是通过定位颗粒内的组胺来定位肥大细胞。事实上，在过敏性疾病中，类胰蛋白酶和组胺都参与反应，而类胰蛋白酶的升高通常在发病30min后才能被检测到，1～2h达到峰值，半衰期为90min，其免疫活性稳定，更能为过敏性疾病提供有价值的诊断依据。在本研究中我们发现，两组实验组小鼠外周血及胃黏膜中类胰蛋白酶含量高于对照组；高毒力组小鼠胃黏膜类胰蛋白酶含量低于低毒力组，但外周血中类胰蛋白酶含量却高于低毒力组，这可能与胃黏膜产生的类胰蛋白酶大量释放到外周血中有关。结果提示，Hp感染时胃黏膜中肥大细胞释放大量活性物质入血，故感染部位的组胺、类胰蛋白酶含量降低，外周血中含量增加，而释放到外周血中的这两种物质可以进一步诱发或加重CU。在本试验中我们发现，高毒力Hp菌株更能诱导肥大细胞脱颗粒，释放大量的活性物质入血，介导强烈的过敏和炎症反应。

组胺和类胰蛋白酶作为MC脱颗粒的标志，目前国内外已有所研究。血浆中的组胺既可来源于组织中MC，也可来源于血中的嗜碱粒细胞，血浆组胺水平实际上反映这两种细胞的激活状态和数目。类胰蛋白酶作为MC活化后释放的另一种活性物质，在嗜碱粒细胞中含量很低，所以体液中类胰蛋白酶浓度升高被视为MC激活和MC介导疾病的标志[3]。此外，类胰蛋白酶还可刺激人MC脱颗粒[13]，放大MC的效应。故对类胰蛋白酶的测定是否较组胺更利于MC的定位还需进一步的研究证明。

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Discussion of pathogenic mechanism of chronic urticaria induced or aggravated by Helicobacter pylori

LV Jing，LI Yan-xi，XUE Mei，et al
Department of Dermatology, the First People’s Hospital, Chongqing 400011, China

Objective To investigate the changings of histamine and tryptase in BALB/c mice's peripheral blood and gastric mucosal induced by Helicobacter pylori(Hp), therefore to establish the importance role of Hp in the course of chronic urticaria (CU). Methods 90 BALB/c healthy mice were randomized into3 different groups: experimental group1(EG1) experimental group2(EG2)and control group(CG), each group including 30 mice. EG1 and EG2 were given high-toxicity Hp liquid and low-toxicity Hp liquid separatively. CG were given BAS2%. A method for the fluorometric assay of histamine was used to determine the histamine concentration in both the blood and the gastric mucosal of these mice. Tryptase concentration was determined by inmmunohistochemistry and enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) in EG and CG. ResultsIn EG (including VacA+ and VacA- group), the histamine concentration in both the blood and the gastric mucosal were higher than those in CG (P＜0.01); in high-toxicity group, the histamine concentration in gastric mucosal was lower than that in low- toxicity group (P＜0.01), however, there was no significant statistical difference between the histamine concentration in blood (P＞0.01). In EG, the tryptase concentration in both the blood and the gastric mucosal were higher than those in CG (P＜0.01); in high- toxicity group, the tryptase concentration was lower than that in low- toxicity group (P＜0.01), but it was higher in blood (P＜0.01). Conclusion The concentration of histamine and tryptase in BALB/c mice, peripheral blood and gastric mucosal both increased because of Hp. This may be an important cause of inducing or aggravating of CU.

Helicobacter pylori；Chronic urticaria；Toxicity；Histamine；Tryptase

R758.24

1674-1293(2011)01-0012-04