周佳雁综述 马向华审校

脂肪源性干细胞(ADSCs)用于血管再生性治疗的研究进展

周佳雁综述 马向华审校

当组织发生缺血性病变时,机体会以自发生成新血管方式缓解缺血缺氧、延缓疾病进展。但是,在一些存在动脉粥样硬化危险因素及其他全身性疾病的患者,机体的这种自发血管生成机制受到限制。因而需研究针对这种缺血性疾病的新治疗方法——“血管再生性治疗”,而在大部分实验和临床前研究中主要采用干细胞移植。本文就脂肪源性干细胞(Adipose Derived Mesenchymal Stem Cells,ADSCs)用于血管再生治疗的研究进展作一综述。

1 ADSCs的特点及其促血管生成研究

1.1 干细胞的选择及ADSCs的特点

成人的血管再生可以动员骨髓中的内皮祖细胞(Endothelial Progenitor Cells,EPCs)和间充质干细胞(Bone M arrow-derived M esenchymal Stem Cells,BM-MSCs)来完成,通过骨髓动员的EPCs进入外周循环中,最后至远端器官而发挥促血管再生作用。研究表明EPCs能对内皮损伤产生应答作用[1];移植培养的EPCs参与新生血管形成及损伤的动脉血管壁再内皮化也获得成功。但因EPCs的培养很困难,自我更新能力较差等缺陷[2],使其在临床研究中受到限制。BM-MSCs是目前关注较多的干细胞,且动物模型及临床应用均证实通过移植BM-MSCs至缺血骨骼肌可成功促使血管形成[3]。但自体移植BM-MSCs治疗缺血性疾病存在很多限制因素,如操作方法的侵袭性太大,促使血管形成的机制目前尚不成熟,临床试验显示这种方法对治疗周围血管闭塞性疾病晚期患者效果较差[4]。因此,近年来越来越多的学者开始寻求新的干细胞。

国外研究资料[5]显示,脂肪组织中含有大量能够贴壁培养、快速增殖、具有多向分化潜能的间充质干细胞ADSCs,且来源广泛、便利,对供者的损伤也小,即使是很少量的人皮下脂肪组织,都可以分离出这种细胞,并且可以培养扩增[6]。有报道称,从2006年起,美国每年经脂肪抽吸术获得且没有妥善利用的皮下脂肪组织超过3L[7],而经过提纯可获得的ADSCs约为400 000个细胞/m l[8]。因此,自体皮下脂肪是很好的干细胞来源。Peroni等[9]发现60种同时参与人ADSCs及人BM-MSCs基因组的基因,都能影响组织生长、修复及内环境的稳态;也有研究发现[10～13]ADSCs与 BMMSCs相似,亦可分化为成骨细胞、软骨细胞、神经细胞、肌细胞等。因此,很多关于ADSCs促血管再生治疗缺血性疾病的研究正逐渐开展。

1.2 ADSCs促血管再生的研究现状

国内外大量研究显示ADSCs可以促血管形成,从而成功治疗缺血性疾病。M adonna等[14]在体外将鼠ADSCs分别接种于甲基纤维素培养基Methocu lt M 3534及基质胶(Matrigel)上,培养过程中均出现接种的ADSCs形成分支管状的结构网。Kang等[15]认为ADSCs可有效促使内皮细胞增殖,促新生血管形成。M iranville等[16]将ADSCs肌肉注射至小鼠缺血下肢,移植后局部血流量明显改善,且局部毛细血管密度显著增加。Kondo等[17]在下肢缺血的小鼠模型中以肌肉注射磷酸盐缓冲溶液为对照,分别肌肉注射ADSCs及成熟脂肪细胞(M As),结果显示移植ADSCs组血流灌注得到更好的改善。但有趣的是,相对于注射磷酸缓冲溶液组,肌注M As组促血管生成的能力更差。研究其原因可能呈 MA s分泌的一些细胞因子,包括肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及白介素-6(IL-6)等,在MAs促血管形成中起到负性调节作用[18]。Hong等[19]报道的早期临床试验结果显示,ADSCs通过促血管形成、改善局部血供,可缓解很多缺血性疾病的发生、发展,包括急性心肌梗死、周围血管性疾病、骨及软组织损伤、Crohn's瘘管、皮肤损伤。

2 ADSCs促血管再生的机制

关于ADSCs治疗缺血性疾病的机制,目前尚存争议。

2.1 ADSCs分化为内皮系细胞促血管形成

以往研究均显示,移植的ADSCs是在体内分化为内皮系细胞,如EPCs或成熟内皮细胞(ECs),从而成功治疗缺血性疾病。如Fischer等[20]将 ADSCs置于含 50μg/m l牛下丘脑提取物ECDS(一种内皮细胞生成添加剂)的内皮细胞培养基中,并予以适当的剪切力,发现ADSCs可以分化为内皮系细胞;Brzoska等[21]在ADSCs培养过程中加入全反式维甲酸二甲基亚砜,亦得到内皮系细胞;国内很多学者[22,23]使用血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维生长因子(b-FGF)在体外诱导ADSCs向内皮细胞分化也均已获得成功。

但是近年来国外一些研究指出,脂肪组织中存在另一种间充质细胞,即血管间充质细胞(SVF),其包含了多能间充质干细胞/祖细胞(包括成纤维细胞、脂肪细胞、周细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌细胞),从而可以分化为不同的细胞系,因此,即使ADSCs在体外及体内实验成功分化为内皮细胞,仍不能排除SVF在其中的干扰作用。Traktuev等[18]研究发现使用内皮细胞培养基 EGM-2不能将人ADSCs分化为ECs。M urohara[24]为模型动物移植绿色荧光蛋白(GFP)标记的ADSCs,发现移植的ADSCs不能表达内皮细胞标志物。因此,目前关于ADSCs是否能向内皮系细胞分化,尚存争议。

2.2 ADSCs通过旁分泌细胞因子促血管形成

近年来很多研究显示ADSCs可分泌促血管生长因子,如肝细胞生长因子(Hepatocyte Grow th Factor,HGF)、基质衍生因 子-1(Stromal-Cell Derived Factor-1,SDF-1)、VEGF[24～26]等。Rehman等[27]研究发现每 106个 ADSCs可分泌1 203±254 pg VEGF,若将 ADSCs置于缺氧环境中,ADSCs分泌VEGF水平可增加5倍左右,移植处内皮细胞呈现显著增殖(P＜0.001),且凋亡明显减少(P＜0.05)。有研究显示,VEGF-A介导的促血管生成作用呈部分依赖SDF-1及其趋化因子受体 4(CXCR4)途径的激活[28,29]。

2.2.1 HGF:最初认为HGF是特异作用于肝细胞的细胞因子,近年来越来越多的研究显示HGF具有促有丝分裂、促血管形成、抗凋亡等多种作用,可作用于多种不同的细胞[30-31]。以往有报道称,在外周缺血模型中应用ADSCs加速再灌注或进行组织补救时,ADSC可分泌生理水平的HGF。Zhu等[32]发现,移植后的 ADSCs分泌的 HGF在血管形成过程中起到重要促进作用,经HGF基因转导后ADSCs的促血管形成、改善血供的能力显著增加。Cai等[33]报道,敲除HGF基因后ADSCs促外周缺血组织再灌注能力下降,由此引起局部微血管密度下降。可见ADSCs分泌的HGF对ADSCs的功能有很重要的影响。

2.2.2 SDF-1:SDF-1是一种趋化因子,最初从BM-MSCs骨髓间充质干细胞中分离。Tang等[34]证实SDF-1可增强干细胞在缺血疾病中的疗效。Kondo等[17]在下肢缺血动物模型中以肌肉注射磷酸盐缓冲溶液为对照,移植ADSCs,发现经ADSCs治疗后小鼠体内SDF-1 mRNA及其相关蛋白水平显著升高,且缺血下肢的血流灌注得到明显改善;但随后予以SDF-1单克隆抗体干预后,ADSCs的疗效显著下降。

SDF-1的主要受体为CXCR4,后者大量表达于骨髓细胞,这就使得SDF-1有广泛的效应细胞。Heissig等[35]研究发现SDF-1可动员CXCR4+的骨髓细胞,其中包括造血干细胞(HSCs)和EPCs。Kondo等[17]在下肢缺血的小鼠模型中移植ADSCs后,发现骨髓 EPCs含量明显增加,由此认为SDF-1可动员EPCs。

目前研究显示,与血管形成相关的受体主要为VEGF受体(VEGFR)、CXCR4+、酪氨酸蛋白激酶生长因子受体(c-Kit),在分别经其配体 VEGF-A、SDF-1、K it配体(KitL)激活后可发挥促血管生成作用。但有研究称VEGF-A[29,34]与c-Kit促血管形成作用呈部分SDF-1-CXCR4+途径激活依赖性。

SDF-1由ADSCs释放后进入外周血,通过复杂的胞吞[36]作用,从外周血中转运至骨髓腔内,进而激活基质金属蛋白酶-9(MMP-9),促使可溶性kit配体(sKitL)释放。随后,sKitL介导更多的SDF-1释放,从而增强对CXCR4+及C-K it++细胞的动员作用,使其进入外周血[35]。另外,一氧化氮(NO)途径亦可扩大SDF-1作用。SDF-1可促使内皮细胞释放NO,使MMP-9水平上调。A icher等[37]在敲除一氧化氮合成酶(NOS)的小鼠模型中发现其MMP-9的激活、sK itL的释放及促血管生成细胞均受损,由此可见NO在SDF-1介导的骨髓细胞动员中起到十分重要的作用。

2.2.3 骨髓衍生循环细胞(RBCCs):ADSCs旁分泌SDF-1使得局部 SDF-1含量增多,从而使 VEGF表达上调,而VEGF亦可反作用增加 SDF-1及 CXCR4的表达[38]。VEGF-SDF-1促血管生成作用的主要步骤包括动员、转移、募集至局部缺血部位、粘附、侵袭、捕获及滞留 RBCCs。在这一过程中,VEGF及SDF-1起着核心作用。局部表达的VEGF可捕获 RBCCs,刺激血管原位ECs增殖。SDF-1可增强VEGF介导的内皮型NOS(eNOS)合成的相关通路,同时亦可募集CXCR+RBCCs。更重要的是,SDF-1可滞留募集的细胞,将这些细胞准确定位在新生血管周围组织,从而进一步放大其促血管形成作用。募集并定位于缺血部位的RBCCs通过分泌血管生成因子[39],促使血管壁内皮细胞生长,改善局部血流灌注。

3 ADSCs在血管再生性治疗中的问题

虽然在体外培养及动物模型中均已证实ADSCs移植后可促使血管形成、改善局部血流灌注,治疗缺血性疾病。但是目前关于ADSCs临床应用前的研究仍存在很多尚待解决的问题。

3.1 ADSCs的移植数量

在BM-M SCs促血管再生的动物模型研究中发现,注射过多的细胞会导致一些负作用,因此有必要研究注射移植ADSCs的最有效剂量。

3.2 ADSCs的分离方法

近年来报道的分离方法是将ADSCs予以胶原酶消化,随后使用特定的装备进行机械离心分离。这种方法在整形外科手术中的脂肪组织再生中被证明是十分有效的[40,41],且不需要细胞培养系统及不需要建立细胞加工中心。如果两种类型的ADSCs,即新分离的ADSCs和培养后的ADSCs在促血管分化能力上具有相似的能力,则有必要选择使用一种机械装备来进行血管形成性治疗。3.3 缺血性疾病移植ADSCs的疗效评估

ADSCs的数量及功能与患者存在的并发症及动脉粥样硬化等危险因素相关,例如在2型糖尿病[42]中SDF-1的分泌水平降低;存在多种危险因素包括糖尿病、高血压、高龄、吸烟等的患者,其体内的祖细胞数量和功能降低。这些病症通常存在于周围动脉闭塞性疾病及血管闭塞性脉管炎(Buerger's疾病)患者。但现在尚未明确ADSCs的数量及功能是否一定会受这些危险因素的影响。因此,在使用促血管形成的治疗学方法前,应该对这些问题进行评估。

4 小结与展望

ADSCs来源广泛、取材方便,且体内、体外实验均证实可通过促血管形成、改善局部血供,缓解很多缺血性疾病的发生、发展,因此受到越来越多的研究者关注,成为可替代BM-MSCs的新的干细胞治疗手段。近年来大量研究发现ADSCs可分泌大量促血管生成的细胞因子,但具体机制尚待进一步明确。虽然目前在ADSCs临床应用中还有许多尚待解决的实际问题,但随着研究的进一步深入,相信在未来,ADSCs可为缺血性疾病的治疗带来新的希望。

本文第一作者简介:

周佳雁(1985～),女,汉族,硕士研究生

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