牛轮状病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

2011-03-13侯美如侯喜林高俊峰刘振格王杰杨明发

黑龙江八一农垦大学学报 2011年3期

侯美如，侯喜林，高俊峰，刘振格，王杰，杨明发

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆163319）

牛轮状病毒是引起犊牛腹泻的重要病原之一[1]。本病主要感染1～7日龄的犊牛，可引起犊牛消化道机能紊乱，临床上以呕吐、腹泻、脱水和酸碱平衡紊乱为特征。感染牛常发生死亡，病死率可达50%。

目前检疫、诊断BRV常用的方法为中和试验、病毒分离、琼扩试验、RT-PCR等。但这些方法都存在着检测时间长或敏感性低等缺点，尤其对处于免疫耐受和持续性感染的牛容易出现漏检。研究以实验室分离并保存的BRV-DQ株建立了双抗体夹心ELISA检测方法，旨在为牛轮状病毒的快速诊断和病原学调查提供一种更好的方法。

1 材料与方法

1.1 细胞、毒株与实验动物

MA104细胞黑龙江八一农垦大学传染病实验室保存。牛轮状病毒（BRV-DQ株），牛呼吸道合胞体病毒（BRSV）、牛冠状病毒（BCV）和牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）均由黑龙江八一农垦大学传染病实验室分离保存；待检40份牛腹泻样品收集于大庆某牧场；2.0-2.5 kg的健康雄性家兔，购买于当地养殖户；体重18-22 g昆明小鼠，购买于长春生物制品研究所。

1.2 主要试剂

DMEM培养基、新生牛血清、胰蛋白酶（1∶250）均购自GIBCO公司；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂和HRP标记的羊抗鼠抗体购自 Sigma公司；Q sepharoseTMFast Flow购自HiPrep公司。

TrizolReagent购自Invitrogen公司；M-MuLV反转录酶（200U·μL-1）、HPR IRNA酶抑制剂（40U·μL-1）、dNTP（10mmoL·L-1）、LA Taq DNA聚合酶（5 U·μL-1）、dNTPs（2.5 mmoL·L-1）、DNA Marker DL2 000均购自TaKaRa公司；DEPC水、琼脂糖均购自Sigma公司；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。