徐 倩 周晓慧 曹 凯 牛成伟 张金环 胡欣欣

同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是非蛋白构成型含硫的非必需氨基酸，是蛋氨酸代谢过程中的一个重要中间产物。研究表明Hcy可以促进动脉粥样硬化及血栓的形成[1]。本研究通过观察在Hcy刺激下人脐静脉内皮细胞（human umbilical veins en⁃dothelial cells，HUVECs）的核因子（NF）-κB、NF-κB抑制蛋白-α（IκB-α）的表达情况，探讨Hcy致动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）的机制，为临床预防治疗AS提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 材料 胰蛋白酶、Ⅰ型胶原酶、Hcy、四甲基噻唑氮蓝（MTT）均购自Sigma公司，DMEM培养基购自Gibco公司，碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）购自pepro Tech公司。Trizol购自invitrogen公司。鼠抗人NF-κB p65抗体、β-actin抗体购自Santa Cruz公司。兔抗人IκB-α一抗，二抗（山羊抗兔IgG/辣根酶标记）购自北京中杉金桥生物技术有限公司。TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0购自宝生物工程（大连）有限公司。 HERAcell 150型CO2孵育箱（Heraeus公司）、LEICA DMIL 090-135.001型倒置显微镜（Wetzlar GmbH公司）、净化工作台（上海新苗医疗器械制造有限公司）、Multiskan Mk3酶联仪（芬兰）、DYY-7型转移电泳仪（北京市六一仪器厂）、PTC-100（MJ RESEARCH, INC）、紫外可见分光光度计（DU800）购自BECKMAN COUL⁃TER公司。

1.2 HUVECs培养及分组 取健康剖宫产新生胎儿脐带，PBS液冲洗干净，用1∶1的0.1%Ⅰ型胶原酶和0.25%的胰酶-0.02% EDTA（V∶V=1∶1）消化13 min，收集消化液，1 000 r/min离心10 min后，弃上清，用含20%胎牛血清、10 μg/L bFGF的DMEM培养基重悬，接种于25 cm2培养瓶中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。24 h后换液，待细胞达到80%融合时，用0.125%胰酶-0.01%EDTA（V∶V=1∶1）传代培养，实验用第2、3代细胞，分组如下：正常对照组细胞加含20%胎牛血清和10 μg/L bFGF的DMEM培养基；Hcy剂量组细胞在加入上述培养基基础上再分为4组，分别加入2.5 mmol/L Hcy（H1）、5 mmol/L Hcy（H2）、10 mmol/L Hcy（H3）及15 mmol/L Hcy（H4）。

1.3 MTT法检测细胞活性 将第2代HUVECs细胞以1.0× 108/L密度种于96孔板中，在37℃，5%CO2培养箱内培养至细胞达到80%融合时，按上述实验分组处理，培养24 h后，每孔加入5 g/L MTT 20 μL继续培养4 h，吸弃上清液，每孔加入二甲基亚砜150 μL。……