谭周才，刘祝祥，贺 乐，向 芬，陈奇辉，石进校

（吉首大学植物资源保护与利用湖南省高校重点实验室，吉首大学生物资源与环境科学学院，湖南 吉首 416000）

内生真菌（Endophytic fungi）一词首先是由De Bary在1886年提出，系指生活在植物组织内的微生物。Petrini进一步将概念扩展为：生活史中某一段时期生活在植物组织内，对植物组织没有引起明显病害症状的微生物[1]。内生真菌，不但能产生与宿主相同或相似的化学成分，而且，还能够独立产生丰富的次生代谢产物。从内生真菌次生代谢产物中分离出来的生物活性物质有51%是新物质，具有重要研究价值[2-7]。蛇足石杉的药效成分石杉碱甲（Huperzine A）临床上已用于治疗各种原因和不同年龄组的老年人记忆减退和早期老年痴呆症，疗效显著[8]。石杉碱甲化学合成有其难以克服的局限性[9]，天然石杉碱甲主要还是从蛇足石杉等植物中提取。由于石杉碱甲在植物中含量非常低，植物生长缓慢，导致石杉科植物的掠夺式采挖，从而破坏了天然资源的可持续开发。因此，通过人工栽培或分离蛇足石杉内生真菌，寻找能产生石杉碱甲的内生真菌显得尤为重要。尽管内生真菌能产生与宿主相同化学成分，但产量低，难以产业化，通过栽培药用植物，满足市场需求仍然是主要手段。沈晓霞等[10]对蛇足石杉外植体进行组织培养时，发现植株中有内源真菌的共生，并标记了内源真菌的共生部位。石玮等[11]从千层塔的茎中分离出4株内生真菌，分别属于顶孢霉属、单轴霉属、酵母和青霉属。黎万奎等[12]从蛇足石杉中分离出支顶孢属内生真菌菌株能够产生石杉碱甲，有望成为石杉碱甲新药源。徐巧玉等[13]对湘西产蛇足石杉内生真菌进行了研究，从蛇足石杉中共分离出5株内生真菌，其中一株经过初步鉴定为枝孢霉。本重点实验室在开展湘西产蛇足石杉内生微生物多样性研究时，得到一株内生真菌，现将分离和鉴定结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 植物材料 蛇足石杉植株采自湖南古丈县，采样时选取健康、生长较为旺盛的植株，采集时带根部土采集，带回实验室后，立即对材料进行内生真菌的分离。

1.1.2 培养基 分离培养基：PDA培养基，察氏培养基。

1.1.3 主要试剂 分子生物学试剂购自上海生物工程公司，ITS 扩增和测序引物（ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC；ITS5：GGAAGGTAAAAGTCAAGG）由宝生物工程（大连）公司合成。

1.2 方 法

1.2.1 内生真菌的分离纯化 将采集的蛇足石杉材料，洗净后进行表面消毒。表面消毒程序为：75%乙醇浸泡40 s，无菌水冲洗3～4次，0.1%升汞浸泡8 min，无菌水冲洗3～4次，0.3%双氧水浸泡10 min，无菌水冲洗3～4次，置于无菌水中准备接种。无菌操作把表面消毒后的蛇足石杉植株用刀片切成0.5 cm×0.5 cm大小的组织块，直接接种于分离培养基上，切口与培养基接触，同时将最后一次清洗外植体的无菌水按0.1mL/皿涂布于分离培养基上作为对照。将分离平板和对照平板置于28℃恒温培养箱连续培养10～15 d。在培养期间观察对照平板是否长菌，并将外植体上长出的菌体用接种针依次转接到新鲜的培养基上，分别进行编号，置于28℃恒温箱中培养。采用尖端菌丝分离纯化的方法，将挑出来的真菌经过反复纯化，直到得到纯化的典型菌落。

1.2.2 内生真菌的基因组DNA提取 平板上挑取米粒大小菌丝置于碾钵中，加少许石英砂与600 μL的CTAB溶液匀浆；将匀浆液转入离心管中，置于60℃恒温水浴锅中水浴30min。取出离心管，往离心管中加入600μL抽提液（酚∶氯仿∶异戊醇=25∶24∶1）轻摇至匀，4℃、14 000 r/min 离心 10 min。取上清液约300μL，转管再次抽提，直至两层液相间无白色膜状物质。取离心后的上清液300μL转管，每管中加3 mol/L醋酸钠约30μL，轻摇至匀，补加-20℃无水乙醇600μL，摇匀后转至-80℃冰箱中冷冻15 min。取出离心管，4℃、14 000 r/min离心10min，弃上清液，留沉淀。向离心管中加入70%乙醇 1mL，4℃、14 000 r/min离心 10 min，倒出上清液，再将离心管中沉淀置于37℃干燥箱中烘干。向烘干后的离心管中加入20μL的TE缓冲液，于4℃保存，待用。

1.2.3 内生真菌ITS序列扩增和测序 PCR扩增反应体系：10×Buffer 5.0μL，dNTP 4.0μL（2.5mM/μL）；Primer1 ITS4 1.0 μL （25 pmol/μL），Primer2 ITS5 1.0 μL（25 pmol/μL）；Taq 酶 0.2 μL（3 U/μL），去离子水37.8μL。

PCR反应条件：预变性温度95℃ 1 min；变性温度95℃ 1min，退火温度51℃ 1min，延伸温度72℃ 1 min，共35个循环；35个循环后再72℃ 延伸10min，反应结束后，将反应产物4℃保存。按照上述扩增条件进行ITS序列扩增，扩增产物寄上海英骏生物技术有限公司测序。

1.2.4 ITS序列系统发育分析 将测得ITS-5.8S rRNA FASTA格式的序列用NCBI（National Center for Biotechnology Information）网站提供的BLAST服务，在数据库中搜索高度相似序列，调取同源性高的相关序列组成序列集；然后用CLUSTAl X软件包中的Alignment程序进行多重序列比对，用Trees程序计算序列间的相似性；用BioEdit软件进行序列剪辑；系统进化距离矩阵根据Kimura模型估算；用MEGA 4.1（Molecular Evolutionary Genetics Analysis software 4.1）软件包中相关程序采用邻接法（Neighbor-Joining）进行聚类分析和构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 内生真菌JSM 09的分离纯化

经表面消毒后的外植体接种至培养基上置于25℃恒温培养箱培养10～15 d后，可看到外植体切口边缘有真菌长出，对照培养皿上无菌生长，证明所分离的微生物为内生微生物（如图1）。根据菌落形态、菌落正反面颜色等特征将菌落挑出并编号，采用尖端菌丝分离纯化法，将挑出来的真菌经过反复纯化，察氏培养基分离得到16株，PDA培养基分离得到66株，共得到82株纯化的典型真菌菌落，其中一株真菌编号为JSM 09。

图1 内生真菌分离照片

2.2 内生真菌JSM 09的ITS序列系统发育分析

按照上述方法对内生真菌JSM 09的ITS进行测序和系统发育分析，JSM 09的ITS序列如下：

以非褶菌目Antrodiella属（小薄孔菌属）的Antrodiella citronella菌株为外群，JSM 09基于ITS序列的系统发育分析结果见图2。从图2可以看出，与Antrodiella属同属非褶菌目的Irpex属（耙齿菌属）菌株都聚类在系统发育树一个大枝上，Irpex属的3个不同种菌株在这个大枝上又形成3个独立稳定的小枝，而菌株JSM 09和Irpex属的3个Irpex lacteus菌株系统发育关系最为密切，聚在同一个小枝上，且与Irpex lacteus XSD-2距离最近，相似程度为99%。因此，从系统发育分析来看，JSM 09应为Irpex lacteus。

图2 JSM 09基于ITS序列构建的系统发育树

3 讨 论

以湘西产蛇足石杉为材料，经过严格的表面消毒，从蛇足石杉内分离纯化得到1株内生真菌JSM 09。对JSM 09进行基于ITS序列的系统发育分析结果表明：菌株JSM 09和Irpex属的3个Irpex lacteus菌株聚在一个枝上，且与Irpex lacteus XSD-2距离最近，相似程度为99%，JSM 09鉴定为白耙齿菌（Irpex lacteus）。耙齿菌属（Irpex）由Fries建立，目前在我国报道的有3个种[14]。白耙齿菌菌丝发酵产物，临床上用来治疗因肾小球肾炎所导致的尿少、腰痛、血压升高等症状，能明显消除或减少慢性病人的尿蛋白、红细胞，因此，该菌株有一定利用价值[15]。白耙齿菌原本是森林木材的腐生菌，作为内生真菌被首次报道，腐生真菌作为内源真菌存在于健康植物当中，其生态功能如何，值得进一步研究。

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