匡 勇，袁 娇，夏石头，黄志远，孙一丹，赵炳然

（1.湖南农业大学科学技术处，湖南 长沙 410128；2.湖南农业大学生物安全学院，

湖南 长沙410128；3.湖南农业大学生物科学技术学院，湖南 长沙 410128；4.国交杂交水稻工程技术研究中心，湖南杂交水稻研究中心，湖南 长沙 410125）

水稻是我国最重要的粮食作物之一，两系杂交水稻的推广和应用对我国乃至世界的粮食生产将产生极为深远的影响[1]。发掘和开发新的遗传种质以提高两系杂交水稻的杂种优势是杂交水稻研究的重要课题。野生稻如小粒野生稻（Oryzaminuta，BBCC染色体组型）含有高产、病虫抗性等基因，不仅耐逆能力强，而且持久抗稻瘟病、稻飞虱等病虫害，发掘、转移这些基因是水稻育种中的一个重要方向，转移远缘物种基因组DNA是一条不同于常规理化诱变的种质创新途径。对基因组DNA进行直接操作，可能是利用远缘有利基因、培育超级杂交稻行之有效的技术途径。目前，外源DNA导入水稻的途径主要有“花粉管通道法”[2]及种苗“浸泡法”，前者结实率低，籽粒易产生霉变、发芽率较低，操作时间又受到花时的限制，后者DNA用量较多且转化率较低。在Pena等[3]程序基础上，国交杂交水稻工程技术研究中心赵炳然等[4]用自行改良的“穗颈注射法”创造出一系列新种质材料。在此基础上，作者以其中新种质野威B及其受体亲本V20B为材料，研究了小粒野生稻基因组DNA转移对受体水稻的光合性状的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

试验采用转小粒野生稻基因组DNA水稻野威B及其受体亲本V20B为材料，由国交杂交水稻工程技术研究中心提供。

1.2 试验设计

试验在国家杂交水稻工程技术研究中心实验田中进行。采取随机区组设计，重复3次，小区面积20.0 m2，密度20 cm×20 cm，插单本。小区呈长方形，重复和区间设走道，实验区周围设保护区。田间管理同大田生产管理。

1.3 项目测定及方法

于始穗期（Ⅰ期）、齐穗期（Ⅱ期）、乳熟期（Ⅲ期）、黄熟期（Ⅳ期）、腊熟期（Ⅴ期）分别到田间各小区随机取样，用美国CID公司的CI203型叶面积仪测定叶片叶面积与长宽比，参照《植物生理学实验技术》[5]用80%丙酮浸提法提取叶绿素，用分光光度法测定叶绿素含量。光合速率、气孔导度、蒸腾速率等指标的测定采用美国LICOR公司的LI6400光合测试系统，采用开放式气路，光通量密度为850 μmol/（m2·s），温度为30℃。分别于9月1日（Ⅰ期）和9月18日（Ⅱ期）测定倒1（剑叶）、倒2、倒3叶光合性状，测定时间为上午 9∶00～10∶00。

2 结果与分析

2.1 小粒野生稻（Oryzaminuta）DNA的导入和野威B材料的获取

以V20B水稻亲本作为野生稻（Oryzaminuta）DNA的受体材料，于田间选受体剑叶与倒2叶叶枕距1～5 cm的主穗，剥开部分倒2叶叶鞘以露出穗颈节下第1节间，然后将医用微量进样器针尖倾斜（约30°）从穗颈节部位朝下插入穗颈节下第1节间注射DNA。每穗注入50μLOryzaminuta基因组DNA溶液（DNA为1×SSC溶液，浓度为300～600 μg/mL）。种子收获后单粒繁殖，从260株D1植株中筛选出1株变异株，变异株繁殖后从D2代中选出优良单株，D3代开始与V20A测交，D4代开始成对回交，经多代回交和系选，选育成变异系野威B。

2.2 转Oryzaminuta基因组DNA水稻野威B的株叶形态和叶绿素含量

转Oryzaminuta基因组DNA的野威B和亲本V20B在株叶形态上有十分明显的差异，野威B的株型较V20B松散，茎较V20B细小，倒3叶叶片较窄、较直立。在始穗期（Ⅰ期）、齐穗期（Ⅱ期）、乳熟期（Ⅲ期）、黄熟期（Ⅳ期）和腊熟期（Ⅴ期）分别到田间各小区随机取样，并用叶面积仪测定叶片的长、宽和叶面积（表1）后，发现在始穗期（Ⅰ期），转O－ryzaminuta基因组DNA的野威B的倒1、倒2和倒3叶叶面积均显著小于亲本V20B，野威B的倒1、倒2和倒3叶的叶长、叶宽也小于亲本V20B，且倒1和倒2的叶长、倒2叶叶宽与受体亲本之间的差异达到了显著水平。在齐穗期（Ⅱ期），野威B的倒1、倒2和倒3叶叶面积虽小于亲本V20B的，但只有倒1叶的叶面积与受体亲本之间的差异达到了显著水平。而在乳熟期（Ⅲ期）、黄熟期（Ⅳ期）和腊熟期（Ⅴ期），野威B的倒1、倒2和倒3叶叶面积均显著小于亲本V20B，野威B的倒1、倒2和倒3叶的叶长、叶宽也小于亲本V20B，有的差异达到显著水平。进一步的研究发现（图1、图2），随着水稻成熟野威B的倒1叶和倒2叶，从始穗期（Ⅰ期）、齐穗期（Ⅱ期）到乳熟期（Ⅲ期）再到黄熟期（Ⅳ期）和腊熟期（Ⅴ期），其叶绿素含量逐渐降低，但其与受体亲本V20B之间的差异未达到显著水平。

表1 转Oryzaminuta基因组DNA野威B水稻的叶面积、叶长和叶宽

图1 不同时期倒1叶叶绿素含量变化

图2 不同时期倒2叶叶绿素含量变化

2.3 转Oryzaminuta基因组DNA水稻野威B的光合性能和蒸腾速率

图3 不同时期倒3叶叶绿素含量变化

转Oryzaminuta基因组DNA的野威B和亲本V20B的光合性能和蒸腾速率如表2。由表2可知，在2个测定时期，转Oryzaminuta基因组DNA的野威B的倒1、倒2和倒3叶片的光合速率均极显著高于亲本V20B的光合速率。除第Ⅱ个时期倒1叶的气孔导度与亲本V20B的气孔导度没有显著差异外，其他时期野威B的倒1、倒2和倒3叶的气孔导度均显著高于亲本V20B的。在第一个测定时期，野威B的倒1、倒2和倒3叶片的蒸腾速率均显著高于亲本V20B各对应时期的蒸腾速率，但在第Ⅱ个时期，两者之间的规律不明显。

表2 转Oryzaminuta基因组DNA野威B水稻的光合速率、气孔导度和蒸腾速率

3 讨论

转移远缘物种基因组DNA是一条不同于常规理化诱变的种质创新途径，对基因组DNA的直接操作，可能是一种利用远缘有利基因、培育超级杂交稻的行之有效的技术路线。外源DNA导入水稻的途径，多是运用“花粉管通道法”[2]及种苗“浸泡法”。在Pena[3]程序基础上，赵炳然、周建林等[4-9]用自行改良的“穗颈注射法”，创造出包括野威B在内的一系列新材料。而将3H-PBI121 DNA注入穗颈节下第一节间，放射性标记迅速在穗颈导管中出现，说明外源DNA通过导管运输[10]。

本文研究发现，通过转小粒野生稻（Oryza minuta）DNA而选育的变异系野威B，与亲本V20B在株叶形态上有十分明显的差异，野威B的株型较V20B松散，茎较V20B细小，倒3叶叶片较窄、较直立，而且野威B的倒1、倒2和倒3叶的叶面积均显著小于亲本V20B。从始穗期（Ⅰ期）、齐穗期（Ⅱ期）到乳熟期（Ⅲ期）再到黄熟期（Ⅳ期）和腊熟期（Ⅴ期），野威B和V20B的叶绿素含量逐渐降低，但两者之间差异未达到显著水平。野威B的倒1、倒2和倒3叶片的光合速率均极显著高于亲本V20B的光合速率。研究表明[11]，作物生物学产量中，90%～95%的物质来自光合作用的产物，只有5%～10%的物质是来自根部吸收的营养物质。从光合作用与物质生产的角度看，水稻产量主要决定于光合面积、光合时间、光合速率和物质分配。在一定产量水平下，其中某一因素起主导作用[12]。野威B的光合速率均极显著高于亲本V20B的光合速率，可为杂交水稻超高产育种，为进一步提高杂交水稻品质提供了新的种质资源。

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