王建英 马俊英 吴淑娟 程建新 李勇

人类非经典白细胞抗原HLA-G在绒毛滋养细胞表面大量表达，是妊娠成功的必要条件，其在母胎免疫耐受方面的作用已经得到公认，目前也是肿瘤免疫逃逸基础研究的热点之一。已有研究报道了黄体酮、绒毛膜促性腺激素、孕激素等可通过上调HLA-G的水平以达到保胎的目的，由此推测临床的引产药物如天花粉蛋白、米非司酮等引起流产的机制可能与其能下调HLA-G的水平有关［1］，进而推测这些药物在免疫逃逸方面具有抗肿瘤作用。本部分研究首先筛查出表达HLA-G阳性的卵巢癌细胞株，进而研究天花粉蛋白、米非司酮对其中HLA-G mRNA表达的影响，并与顺铂相比较，以其为卵巢癌的免疫治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 培养细胞:卵巢癌细胞株卵巢浆液性囊腺癌(SKOV3)、卵巢粘液性囊腺癌(3AO)、卵巢腺癌细胞株(OVCAR3)，由河北省肿瘤研究所科研中心提供。高表达HLA-G的绒毛膜癌JEG-3细胞株，购于中国科学院动物研究所计划生育及生殖生物学国家重点实验室。

1.1.2 主要试剂:RPMI1640细胞培养基购于美国Gibco公司;胎牛血清购于杭州四季青公司;四甲基偶氮唑蓝(MTT)购于Sigma公司;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒购于Fermentas公司;引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。HLA-G上游引物为 5，-AGA CGC CAA GGA TGG TGG TCA-3，下游引物为 5，-GCTCCA CGT CCTGGG TCTGGT-3;βactin上游引物5，-AAG AGA GGC ATC CTC ACC CT-3，下游引物为5，-GGA AGG AAG GCTGGA AGA TG-3。扩增产物:HLAG为770 bp，β-actin为619 bp;HLA-G单克隆抗体购于英国Abcam公司;天花粉蛋白注射液购于上海金山制药厂;米非司酮纯品(RU486)购于北京紫竹药业有限公司;顺铂购于山东齐鲁制药厂。

1.1.3 仪器设备:酶标仪 Fluostar(BMG，德国);CO2培养箱(Heraeus，德国);倒置显微镜(Olympus，日本);HEALORCE 超净工作台。PCR 仪(Mastercycler，eppendorf，德国)、凝胶分析成像系统(VILBER，LourMAT，法国)

1.2 方法

1.2.1 SKOV3、3AO、OVCAR3细胞培养:用含10%胎牛血清、100 U/m l青霉素、100 g/m l链霉素，在37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养，以0.25%胰蛋白酶消化，2～3 d传代1次。

1.2.2 JEG-3细胞培养:用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 g/ml链霉素、2 mmol/L的DMEM/F12培养液，在37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养，以0.25%胰蛋白酶消化，2～3 d传代1次。

1.2.3 RT-PCR技术:用Trizol试剂盒提取细胞总RNA，用紫外分光光度法定量RNA。将等量的RNA反转录为cDNA第1链，以获得的逆转录产物为模板，扩增HLA-G和β-actin基因，使用凝胶分析系统对扩增条带进行密度分析，以平均灰度值代表相应基因的表达量，并除以β-actin的平均灰度值，所得数值做为各扩增产物mRNA的相对表达量。扩增条件:HLA-G为94℃预变性 3 min，94℃ 变性 45 s，55℃退火 45 s，72℃ 延伸1 min，30个循环，72℃延伸7 min。1%琼脂糖凝胶电泳80 V 30 min，观察基因表达变化。实验重复6次。

1.2.4 四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)测定:取对数生长期的细胞，调整细胞浓度为2×105/ml，接种于96孔培养板中，每孔100μl，贴壁培养24 h后分别加入不同浓度的药物或对照液100μl，每个浓度设6个复孔，每板设3个空白对照孔。细胞培养72 h后，每孔加入10μl MTT(浓度为5 mg/ml)，继续培养4 h后，弃培养液，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150μl，振荡10 min，酶标仪在600 nm处测定每孔吸光度(A)值，每个浓度6个平行孔，取平均值。并按如下公式计算各组细胞的生长抑制率。实验重复5次。细胞生长抑制率=(对照孔A值-实验孔A值)/对照孔A值×100%。80 V 30 min，观察基因表达变化。实验重复2次。

1.2.5 药物浓度:用不含胎牛血清的RPMI1640细胞培养液来调节天花粉蛋白和顺铂药物浓度，每种药物为5个浓度。天花粉蛋白注射液的终浓度 10、50、100、500、1 000 μg/ml。顺铂的终浓度为 1.5625、3.125、6.25、12.5、25 μg/ml。以等量的RPMI1640培养液为对照。

米非司酮纯品以无水乙醇溶解，配成10 mg/ml，再以RPMR1640培养液稀释至所需浓度，试验组米非司酮终浓度分别为 2.5、5、10、20、40 μg/m l。为避免乙醇对试验的影响，设 5个乙醇对照组，使乙醇终浓度与各试验组乙醇含量一致。

RT-PCR技术:参照上述结果，选择干预细胞的药物浓度。天花粉蛋白注射液浓度为500、1 000μg/ml;米非司酮浓度为20、40 μg/m l;顺铂浓度为6.25、12.5 μg/ml。各组药物分别作用于实验筛查出表达HLA-G阳性的OVCAR3细胞72 h。

1.3 统计学分析应用SPSS 13.0统计软件，计量资料以±s表示，组间均数先进行方差齐性检验，再进行方差分析，用LSD法进行两两比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 卵巢癌细胞HLA-GmRNA表达 以绒癌JEG-3细胞为阳性对照，人卵巢癌OVCAR3细胞株呈现HLA-G mRNA阳性表达，可见扩增片段长度为770 bp(HLA-G)和619 bp(β-actin)的特异性条带。SKOV3和3AO细胞中均未检测到HLA-G mRNA表达。见图1。

图1不同细胞株HLA-GmRNA的表达

2.2 天花粉蛋白、米非司酮、顺铂对卵巢癌细胞株OVCAR3生长的抑制作用 天花粉蛋白、米非司酮、顺铂对OVCAR3细胞生长抑制作用均呈浓度依赖性。见表1。

表1不同药物对卵巢癌细胞株OVCAR3生长的抑制作用±s

表1不同药物对卵巢癌细胞株OVCAR3生长的抑制作用±s

天花粉蛋白浓度(μg/ml)抑制率米非司酮浓度(μg/ml)抑制率顺铂浓度(μg/ml)抑制率0 0 0 0 0 0 10 1.06±0.14 2.5 8.00±1.21 1.5625 17.82±7.29 50 9.03±1.81 5 24.88±11.30 3.125 29.25±2.72 100 14.95±8.43 10 47.60±2.70 6.25 60.15±5.69 500 39.66±9.67 20 61.58±3.29 12.5 70.57±3.74 1 000 58.65±9.63 40 76.94±4.68 25 85.67±8.24

2.3 天花粉蛋白、米非司酮、顺铂对OVCAR3细胞中HLA-G表达的影响 天花粉蛋白、米非司酮能明显下调OVCAR3细胞中HLA-G mRNA表达水平(P＜0.01)，而顺铂却无该方面作用(P ＞0.05)。见表2。

表2 不同药物对OVCAR3细胞中HLA-G表达的影响

3 讨论

本课题组前期试验已经表明HLA-G、HLA-E在卵巢癌免疫逃逸中起着重要作用，可做为临床判断肿瘤恶性程度、监测肿瘤复发及判断预后的一项肿瘤标志物，提示若能找到某种药物来下调或封闭HLA-G、HLA-E的表达，就有可能为临床卵巢癌免疫治疗提供一个新的靶点［2］。

本试验以绒癌JEG-3细胞做为阳性对照，检测了不同卵巢癌细胞株中HLA-G的表达情况，结果表明在SKOV3细胞和3AO细胞都不表达HLA-G，只有在 OVCAR3细胞有 HLA-G mRNA电泳条带出现。细胞系中HLA-G的表达低于肿瘤组织，同国外学者研究结果相似。Bukur等［3］研究发现在被检测的30例肾癌肿瘤标本中24例有HLA-G mRNA表达，而在23个细胞系中仅12例有HLA-G mRNA表达。还有文献报道HLA-G抗原在黑色素瘤标本中近30%表达，而在细胞系中却不到1%［4］。分析产生这些差异的原因可能是:(1)不同肿瘤微环境的影响;(2)肿瘤浸润细胞的影响，因为它们也表达HLA-G;(3)在细胞培养过程中HLA-G抗原会逐渐部分丢失;(4)在建立稳定传代的细胞系过程中不可避免发生某种程度的细胞选择，从而使HLA-G阳性细胞可能被筛选掉。

本部分结果表明虽然不同卵巢癌细胞株表达HLA-G水平有所不同，但还是从细胞水平验证了HLA-G在卵巢癌免疫逃逸方面的作用。故以OVCAR3做为下一步进行药物干预实验的细胞株。

王英俊［5］研究发现天花粉蛋白(TCS)可诱导胃癌细胞株SGC-7901凋亡，凋亡率与药物浓度及作用时间呈正相关。王媛媛等［6］探讨了TCS对人白血病和淋巴瘤细胞系的杀伤作用机制，结果表明TCS可以显著抑制各种白血病细胞系的增值。目前关于TCS与卵巢癌关系的研究报道极少。本组资料显示，天花粉蛋白从50μg/ml浓度开始对卵巢癌细胞株OVCAR3表现出抑制作用，而且浓度越高，抑制作用越强，1 000μg/ml时，抑制作用达到58.65%。体外实验表明天花粉蛋白对卵巢癌具有抗肿瘤作用。

目前对天花粉蛋白抗癌机制的研究并不很深入，主要集中于以下几方面:抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡;抑制肿瘤细胞蛋白质的合成;促进NK细胞活性，提高机体免疫力;提高红细胞免疫黏附功能，增强肿瘤细胞抗原性，从而增强抗癌免疫反应等［7-9］。本实验发现天花粉蛋白能明显下调OVCAR3细胞HLA-GmRNA表达水平，而且1 000μg/ml组中HLA-G光密度值显著低于500μg/m l组。抗原水平下调和药物浓度有关，浓度越高，抗原水平越低。因此为天花粉蛋白的抗肿瘤机制提供了另一种可能途径，即通过下调人类白细胞抗原HLA-G、HLA-E水平，解除其与NK细胞、细胞毒性T细胞抑制型受体结合，从而恢复免疫细胞的杀瘤作用而实现的。这为天花粉蛋白的开发和临床应用提供了有力的依据。

抗孕激素米非司酮(RU486，mifepristone)由法国Roussel-Uclaf公司于1980年最先合成，作为一种抗早孕药物在临床被推广使用。米非司酮临床应用领域不断拓宽，并在妇科肿瘤及其他肿瘤如子宫内膜癌、乳腺癌、卵巢癌、脑膜瘤、胃癌治疗等方面进行探索性应用［10-12］。本实验显示米非司酮对卵巢癌细胞系OVCAR3表现出浓度依赖性的抑制作用，表明米非司酮对卵巢癌有较强抗肿瘤作用。目前米非司酮治疗卵巢癌作用机理研究主要局限于拮抗孕激素这一机制，其他方面的报道极少。本组资料中，通过对卵巢癌细胞体外实验研究，我们首先得出结果米非司酮对卵巢癌细胞有明显的增殖抑制作用，然后通过RT-PCR方法基因转录水平检测发现米非司酮能明显下调OVCAR3细胞HLA-G基因mRNA表达水平，同样从肿瘤免疫逃逸机制方面阐明了米非司酮抗肿瘤作用的另一机制，即下调非经典白细胞抗原HLA-G，阻断他们同免疫细胞抑制性受体的结合，恢复免疫细胞的活性，达到杀伤肿瘤细胞的目的。

做为治疗卵巢癌最常用的化疗药物，顺铂作用机制主要是攻击DNA碱基的氮原子，与DNA形成交叉连结，使DNA的模板作用失活，因而可抑制DNA合成。本研究中顺铂对卵巢癌OVCAR3细胞中HLA-G抗原mRNA表达无明显影响。研究结果表明顺铂做为最重要的治疗卵巢癌药物，作用机制方面可能没有参与解除HLA-G诱导的肿瘤免疫逃逸过程。天花粉蛋白和米非司酮治疗卵巢癌的作用机制同顺铂有所不同，与顺铂联合应用，可能会取得更好的治疗效果，为进一步动物移植瘤模型观察药物疗效提供可行性依据［13］，从而为临床制定合理的化疗方案提供依据。

1 朱卫红，魏国华，孙进.天花粉蛋白羊膜腔注射配伍米百司酮用于高危中期妊娠引产的疗效分析.中国全科医学，2009，26:1006-1007.

2 王建英，许茜，吴淑娟，等.卵巢恶性肿瘤组织中HLA-G、HLA-E的表达及意义.山东医药，2010，50:1-3.

3 Bukur J，Malenica B，Huber C，et al.Altered expression of nonclassical HLA class Ib antigens in human renal cell carcinoma and its association with impaired immune response.Hum Immunol，2003，64:1081-1092.

4 Chang CC，Murphy SP，Ferrone S.Differential in vivo and in vitro HLA-G expression in melanoma cells:potential mechanisms.Hum Immunol，2003，64:1057-1063.

5 王英俊.天花粉蛋白对胃癌细胞株SGC-7901凋亡影响的体外研究.中国医药导报，2007，16:231-234.

6 王媛媛，欧阳东云，郑永唐.天花粉蛋白体外抗人白血病和淋巴瘤细胞的作用机制.中国试验血液学杂志，2007，15:729-732.

7 黄益玲，黄利鸣，石新兰，等.天花粉蛋白对宫颈癌HeLa细胞增殖和细胞凋亡的影响.中国药理学通报，2005，21:253-254.

8 孙璟，涂水平，吴裕炘，等.天花粉蛋白诱导胃癌细胞MKN-45凋亡中P53、Bcl-2、C-myc 蛋白表达变化.上海医学，2004，24:292-294.

9 田维毅，马春玲，白惠卿.天花粉及其组份对小鼠NK细胞杀伤活性的影响.贵州中医，2001，25:982-984.

10 Poole AJ，Li Y，Kim Y，etal.Prevention of Brca1-mediatedmammary tumorigenesis in mice by a progesterone antagonist.Science，2006，314:1467-1470.

11 Goyeneche AA，Carón RW，Telleria CM.Mifepristone inhibits ovarian cancer cellgrowth in vitro and in vivo.Clin Cancer Res，2007，13:3370-3379.

12 Grunberg SM，Weiss MH，Russell CA，et al.Long-term administration of mifepristone(RU486):clinical tolerance during extended treatment of meningioma.Cancer Invest，2006，24:727-733.

13 王建英，许茜，吴淑娟，等.药物对卵巢癌裸鼠移植瘤组织中HLAG、HLA-E 表达的影响.河北医药，2009，31:2878-2880.