徐亚英，王 勇，罗 宏，陈 典

（东北农业大学园艺学院，哈尔滨 150030）

基因定位突变是指将某一克隆基因按预先设计好的目标进行定点改造，它仅适用于基因序列已知，蛋白结构与功能的关系比较明确的基因[1]。由于它具有简单易行、重复性高等优点，现已发展成为基因操作的一种基本技术[2]。常见体外定点突变的方法有化学诱变、寡核苷酸介导的诱变、盒式诱变和基于PCR方法的诱变等[3]，其中基于PCR方法的诱变以其简单、快速的优势逐渐成为DNA体外修饰产生新型蛋白质的最常用方法[4]。

Cre重组酶来源于P1噬菌体[5]，它不仅具有催化活性，而且同限制酶相似，可以识别特异的DNA序列并进行特定的剪切和拼接[6-7]。当其作用序列位点—两个34bp的loxP位点存在时，它可根据loxP位点的方向不同发生倒位、移位和删除反应[8-9]。Cre/1oxP已广泛应用于内、外源基因失活或敲除、基因激活等反应[10-11]。目前，Cre/1oxP定位重组系统在应用中存在两个主要问题:Cre重组酶的删除效率较低，其删除效率仅为50%左右[12]；此前，在我们实验室的研究工作中发现，当Cre重组酶与loxP位点共存于一个寄主细胞中时，常由于Cre重组酶的痕量表达而引起loxP位点间序列的非目的性删除。针对以上缺陷，本试验设计了3条引物，利用PCR方法向cre基因内部引入一段具有增强基因在真核生物中表达效率的内含子序列（pfu1305.1）[13]，以改变其在原核细胞中的通读序列，完成cre基因的改造，进而达到提高Cre/1oxP定位重组系统在转基因真核生物中的删除效率的目的同时，也避免了cre基因的渗露表达。……