刘振平 申 晶 宋晓艳

糖尿病患者胰岛素（insulin,INS）相对或绝对缺乏，使升血糖激素和降血糖激素之间的平衡被打乱，导致糖原合成下降，糖异生增加，血糖升高；脂肪合成减少，脂肪分解增加，游离脂肪酸增加；蛋白质合成减少，分解增加，氨基酸（amino acid,AA）代谢紊乱。L-丙氨酸是糖异生最主要的AA，也是肌肉蛋白质分解产生最多的AA之一。有动物研究表明L-丙氨酸在胰岛B细胞中起着关键作用[1]。本文旨在探讨L-丙氨酸对B细胞株INS-1E的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 葡萄糖、氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、牛血清白蛋白、N-2-羟乙哌嗪-N’-2-乙烷磺酸（HEPES）、L-丙氨酸及RPMI1640均购自Sigma公司；自行配制Krebs-Ringer缓冲液（主要成分115 mmol/L氯化钠,4.7 mmol/L氯化钾,1.28 mmol/L氯化钙,5.0碳酸氢钠,25 mmol/L HEPES，调至pH 7.4），INS-1E细胞由C.B.Wollheim教授（瑞士）馈赠。

1.2 细胞培养 INS-1E细胞在37°C培养箱、5%CO2中培养，培养液为改良的RPMI 1640（加有10%胎牛血清，11.1 mmol/L的葡萄糖，10 mmol/L的HEPES，100 IU/mL的青霉素，100 mg/L的链霉素，0.5%牛血清白蛋白），细胞在细颈瓶中贴壁生长，每周传代1次。

1.3 实验设计 为研究L-丙氨酸刺激INS-1E细胞分泌INS的剂量依赖性，分别对16.7 mmol/L葡萄糖加0、0.1、0.25、1、5、10及20 mmol/L的L-丙氨酸；为研究L-丙氨酸刺激INS分泌的葡萄糖依赖性，配制1.1、3.3、6.7、11.1、16.7及25 mmol/L葡萄糖2份，一份为葡萄糖组，另一份各加入10 mmol/L L-丙氨酸的条件做对照比较（葡萄糖+AA组）。

1.4 INS-1E细胞释放胰岛素 应用胰酶消化，培养液稀释，离心收集INS-1E细胞，种植在24孔板中，每孔1 mL，2.5×105个细胞，37℃培养箱、5%CO2培养2 d，移出培养液，加入Krebs-Ringer缓冲液1 mL，37℃培养箱预培养30 min，移出缓冲液；每个孔中分别加入1.1、3.3、6.7、11.1、16.7及25 mmol/L葡萄糖或(和)10 mmol/L L-丙氨酸缓冲液。37℃培养箱培养1 h，从每孔吸取300 μL上清液，1 000 r/min离心2 min，取200 μL上清液-20℃保存待测。移出每孔中剩余的反应液，加入0.1 g/L氢氧化钠1 mL放置30 min溶解细胞，充分混匀收集1 mL溶液，-20℃保存。

1.5 检测指标 各实验组均进行INS和蛋白质的测定。应用大鼠INS（Novo Nordisk）作标准，单125I标记的人INS(Novo Nordisk A/S)作示踪剂，应用豚鼠抗猪INS抗体(Novo Nordisk, Bagsvaerd,Denmark)进行放射免疫测定胰岛素，应用乙醇分离自由的和结合的放射活性，批内变异系数5%，批间变异系数10%。应用Bio-Rad公司的蛋白质测定试剂盒测定蛋白质以校正INS的含量。

1.6 统计学方法 应用GraphPad Prism 4.03软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以±s表示，多组间均数比较采用方差分析，2组间资料比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度L-丙氨酸+葡萄糖刺激INS-1E细胞分泌INS的剂量依赖性 随着L-丙氨酸浓度的进行性增加，INS分泌呈增加趋势，见表1。

表1 不同浓度L-丙氨酸+葡萄糖刺激INS-1E细胞分泌INS的剂量依赖性 （±s）

表1 不同浓度L-丙氨酸+葡萄糖刺激INS-1E细胞分泌INS的剂量依赖性 （±s）

＊P＜0.05

组别(丙氨酸+葡萄糖) n 胰岛素/蛋白质（mg/g）0 mmol/L+16.7 mmol/L 0.1 mmol/L+16.7 mmol/L 0.25 mmol/L+16.7 mmol/L 1.0 mmol/L+16.7 mmol/L 5.0 mmol/L+16.7 mmol/L 10 mmol/L+16.7 mmol/L 20 mmol/L+16.7 mmol/L F 0.62±0.04 0.64±0.05 0.77±0.03 0.92±0.07 1.02±0.03 1.14±0.09 1.24±0.06 42.41＊12 12 12 12 12 12 12

2.2 丙氨酸刺激INS-1E细胞分泌胰岛素的葡萄糖依赖性 与相应的单纯葡萄糖组的比较，除1.1、3.3 mmol/L差异无统计学意义外（P＞0.05），其余各组间比较差异均有统计学意义（P＜0.01）。其中，葡萄糖组内在1.1～25 mmol/L葡萄糖范围内，随着葡萄糖浓度的增加，INS/蛋白质呈增强趋势；葡萄糖+AA组内在1.1～11.1 mmol/L下，INS/蛋白质亦呈增强趋势，见表2。

表2 10 mmol/L L-丙氨酸联合葡萄糖刺激INS-1E细胞分泌胰岛素与相应的单纯葡萄糖组的比较［INS/蛋白质(mg/g)，n=20，±s］

表2 10 mmol/L L-丙氨酸联合葡萄糖刺激INS-1E细胞分泌胰岛素与相应的单纯葡萄糖组的比较［INS/蛋白质(mg/g)，n=20，±s］

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

组别 葡萄糖浓度（mmol/L）1.1 3.3 6.7 11.1 16.7 25葡萄糖组葡萄糖+AA组t 0.22±0.01 0.23±0.02 0.456 0.27±0.02 0.30±0.02 1.147 0.76±0.03 1.07±0.05 5.200＊＊0.85±0.04 1.28±0.07 5.616＊＊0.86±0.03 1.18±0.05 5.012＊＊0.93±0.04 1.35±0.07 5.170＊＊

3 讨论

糖尿病患者持续存在着糖、脂肪及蛋白质的代谢紊乱。研究已经证实高血糖和高血脂对B细胞的急慢性作用[2]，而目前高氨基酸血症对B细胞的急慢性作用研究报道尚少。本研究结果显示，在16.7 mmol/L葡萄糖存在的情况下，随着L-丙氨酸浓度的逐渐增加，INS-1E细胞分泌INS的量逐渐增加，表明了L-丙氨酸对B细胞分泌INS的急性刺激作用。10 mmol/L L-丙氨酸在6.7～25 mmol/L葡萄糖浓度范围内促进葡萄糖诱导的INS-1E细胞的INS分泌，并且随着葡萄糖浓度的增加，INS分泌量也显示了逐渐增加的趋势。但在1.1、3.3 mmol/L葡萄糖存在的条件下，10 mmol/L L-丙氨酸未促进葡萄糖诱导的INS-1E细胞的INS分泌，提示L-丙氨酸促进INS分泌的作用依赖于一定水平葡萄糖的存在。

Brennan等[3]研究证实L-丙氨酸经与钠离子共同转运进入B细胞，经钠离子内流、胞浆膜去极化、电压依赖的钙通道开放及钙离子内流，触发INS胞吐作用。进一步研究发现，L-丙氨酸经钠离子共同转运诱发INS分泌仅占其促INS分泌作用的10%～20%，而经氧化磷酸化代谢产生三磷酸腺苷（ATP），使ATP/二磷酸腺苷（ADP）比值升高，致使ATP敏感的钾通道关闭，胞浆膜去极化，电压依赖的钙通道开放，钙离子内流，触发INS胞吐作用；直接证据是呼吸链毒素寡霉素显著地降低了L-丙氨酸刺激的克隆B细胞的INS分泌[3]。本研究结果亦显示L-丙氨酸促进INS分泌，并且证实其促INS分泌作用依赖于一定的葡萄糖水平，考虑原因为丙氨酸的摄取依赖于葡萄糖氧化磷酸化产生的ATP。正常人血浆中L-丙氨酸含量在0.5 mmol/L左右，本研究结果显示在16.7 mmol/L葡萄糖存在的条件下，0.25 mmol/L L-丙氨酸诱导的INS释放高于单纯16.7 mmol/L葡萄糖，提示L-丙氨酸可能参与了糖尿病高血糖状态下INS分泌的调节。

有研究认为L-丙氨酸促进了B细胞内葡萄糖的代谢，L-丙氨酸与钠离子共同转运致使胞浆内Ca2+增加，Ca2+活化丙酮酸脱氢酶，则来源于葡萄糖的丙酮酸代谢增加[3]；而葡萄糖代谢产生的ATP也促进L-丙氨酸的摄取和利用[1]。本研究结果显示，10 mmol/L L-丙氨酸和1.1、3.3 mmol/L葡萄糖诱导的INS分泌与单纯1.1、3.3 mmol/L葡萄糖诱导的INS分泌的差异无统计学意义。然而，10 mmol/L L-丙氨酸+3.3 mmol/L葡萄糖诱导的INS分泌较10 mmol/L L-丙氨酸、1.1 mmol/L葡萄糖诱导的INS分泌显著增加，提示L-丙氨酸与葡萄糖之间可能有协同作用。有研究指出，B细胞线粒体内谷氨酸浓度是葡萄糖诱导的INS胞吐分泌的递质[4]，并认为L-丙氨酸经代谢为谷氨酸进而促进INS释放[5]。但需要更进一步研究以确认L-丙氨酸在糖尿病高血糖环境下对胰岛B细胞分泌INS的急慢性作用。

[1]Dixon G,Nolan J,McClenaghan N,et al.A comparative study of amino acid consumption by rat islet cells and the clonal beta-cell line BRIN-BD11-the functional significance of L-alanine[J].J Endocrino，2003，179（3）:447-454.

[2] Poitout V,Robertson RP.Glucolipotoxicity:fuel excess and be⁃ta-cell dysfunction[J].Endocr Rev,2008,29（3）:351-366.

[3]Brennan L,Shine A,Hewage C,et al.A nuclear magnetic reso⁃nance-based demonstration of substantial oxidative L-alanine me⁃tabolism and L-alnine-enhanced glucose metabolism in a clonal pancreatic b-cell line[J].Diabetes,2002,51（6）:1714-1721.

[4] Newsholme P,Brennan L,Bender K.Amino acid metabolism, b-cell function,and diabetes[J].Diabetes,2006,55（suppl 2）: s39-s47.

[5]Rubi B,Ishihara H,Hegardt FG,et al.GAD65-mediated glutamate decarboxylation reduces glucose-stimulated insulin secretion in pancreaticbetacells[J].JBiolChem,2001,276（379）:36391-36396.