赵文君 邢国胜 于顺禄 魏学磊 张 凯 陆 芸 郭 刚

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种进行性的关节炎性破坏，以滑膜增生及关节软骨和骨破坏为特征的系统性自身免疫病。慢性炎症过程及细胞因子引起的自身免疫过程可诱发关节破坏。白细胞介素（IL）-23是新近发现的细胞因子，主要由活性单核巨噬细胞和树突状细胞分泌，具有十分复杂的生物学功能。本研究旨在检测RA患者滑膜组织、RA滑膜成纤维细胞(synovial fibro⁃blasts，SF)中IL-23p19 mRNA的表达，并与骨性关节炎(osteoporosis arthritis，OA)滑膜组织、OASF中IL-23p19 mRNA相比较，并分析RA患者滑膜组织、RASF中IL-23p19 mRNA与IL-1β mRNA的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 所有滑膜组织均来源于2008年10月—2009年9月天津医院关节科行滑膜切除术及关节置换术的患者，其中RA患者6例，男2例，女4例，年龄51～61岁，平均（54.0± 3.5）；OA患者6例，男1例，女5例，年龄54～77岁，平均（63.7± 7.9）。诊断符合美国风湿学会1987年修订的RA诊断标准及1986年制定的OA诊断标准，并经术后病理学证实。所有患者均无肿瘤以及其他与免疫相关的疾病。术中无菌切取的滑膜组织分两部分：一部分用于SF体外培养，一部分液氮保存用于RNA提取。

1.2 方法

1.2.1 SF体外培养 DMEM和胎牛血清均购自Gibco公司。无菌切取的滑膜组织，Hank’s反复冲洗，去除表面的滑液。修剪成1 mm3左右的小块，置于0.25%胰酶，37℃消化30 min，弃上清，在剩余组织块中加入1 g/LⅡ型胶原酶，37℃消化2 h。200目纱网过滤，1 000 r/min离心10 min，弃上清，加入含10%胎牛血清的DMEM重悬细胞，接种于培养瓶内，置37℃，5%CO2细胞培养箱内培养。待细胞扩增至一定浓度，常规消化，传代培养。

1.2.2 RNA提取及RT-PCR Trizol购自invitrogen公司，逆转录相关试剂及PCR相关试剂均购自TaKaRa公司，DNA Marker为DL2000。取液氮中冻存的滑膜组织约100 mg及培养的第2代SF，分别加入1 mL Trizol，提取步骤按试剂盒说明进行。实验中所用耗材均经过无RNA酶处理。取RNA 4 mg，oligo(dT)181 μL，加DEPC水补足至5 μL，70℃孵育5 min，取出迅速置于冰盒内，按顺序加入5×RT buffer 4 μL，10 mmol/L dNTP 4 μL，RNA酶抑制剂0.5 μL，反转录酶1 μL。42℃孵育1 h，95℃，5 s，-20℃保存，用于PCR反应。PCR反应总体积25 μL，其中10×buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 1 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，TaqDNA聚合酶0.25 μL，三蒸水18.25 μL，模板1 μL。循环参数：95℃3 min变性，95℃1 min，56℃40 s，72℃1 min，最后延伸72℃7 min，35个循环。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2.3 PCR产物结果分析 取10 μL PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，EB染色。凝胶自动成像分析系统扫描成像，并测定条带灰度值，以目的基因与内参基因GAPDH比值作为目的基因相对表达量。

1.3 统计学处理 采用SPSS 10.0统计分析软件，计量资料描述用M（P25,P75），2组间比较采用秩和检验，相关性采用Pearson直线相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RA与OA患者滑膜组织中IL-23p19 mRNA的表达 6例RA滑膜组织在260 bp处均表达明亮、清晰的特异性条带，6例OA滑膜组织中有4例在260 bp处表达较弱的特异性条带；RA滑膜组织中的表达量为0.306 5（0.244 0，0.380 5），明显高于OA滑膜组织中阳性标本的表达量0.125 4（0.117 5,0.134 0），差异有统计学意义（T=10,P＜0.05），见图1。

图1 RA与OA组织IL-23p19 mRNA扩增产物电泳结果

2.2 RASF与OASF中IL-23p19 mRNA表达 RASF中6例均在260 bp处表达明亮、清晰的特异性条带，OASF中4例在260 bp处表达较弱的特异性条带。RASF中阳性表达量为0.287 0（0.251 5，0.310 7）明显高于OASF中的0.087 9（0.021 5，0.134 2），差异有统计学意义（T=10,P＜0.05），见图2。

图2 RASF与OASF中IL-23p19 mRNA扩增产物电泳结果

2.3 IL-1β mRNA在RA滑膜组织与RASF中的表达及与IL-23p19 mRNA的相关性 6例滑膜RA组织和6例RASF在233 bp处均表达明亮、清晰的IL-1β特异性条带，见图3。在RA滑膜组织中IL-23p19 mRNA的表达量与IL-1βmRNA的表达量0.127 0（0.078 6，0.411 4）呈正相关（r=0.900，P＜0.05），RASF中IL-23p19 mRNA的表达量与IL-1β mRNA的表达量0.083 5（0.063 8，0.115 4）呈正相关（r= 0.883，P＜0.05）。

3 讨论

图3 RA滑膜组织与RASF中IL-1βmRNA扩增产物电泳结果

IL-23主要来源于一些抗原提呈细胞，如激活的树突状细胞，被革兰阳性菌、革兰阴性菌及病毒产物刺激后的单核细胞和巨噬细胞等。IL-23可刺激Th17细胞分泌前炎症细胞因子IL-17[1]，而IL-17也可刺激IL-23p19亚单位的生成[2]，该作用通过激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、细胞核因子（NF）-κB和磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路发挥作用[3]。IL-23、IL-17A和IL-17F在T细胞触发的炎症中发挥着重要作用，如RA、多发性硬化症和系统性红斑狼疮等免疫性疾病，这些因子可上调另外一些参与炎症反应的细胞因子和化学因子的分泌。Brentano等[4]对滑膜组织进行原位杂交，结果显示RA滑膜组织有大量的IL-23p19 mRNA表达，OA滑膜组织不表达或微量表达。本研究结果显示，6例RA患者滑膜组织中均有IL-23p19 mRNA的表达，主要由于RA滑膜组织中含有大量的免疫炎性细胞，包括淋巴细胞、单核巨噬细胞、树突状细胞等，激活的单核巨噬细胞和树突状细胞能分泌大量的IL-23p19。同时，笔者发现体外分离培养的RA患者滑膜成纤维细胞也均表达IL-23p19 mRNA。Brentano等[4]认为体外培养的RA滑膜成纤维细胞在没有刺激因素存在的情况下是不表达IL-23p19 mRNA的，这可能是由于他们选择的是4～8代滑膜细胞，细胞分化程度与体内有所不同；而本研究使用的第2代细胞，更接近于体内细胞状态。本研究中，6例OA滑膜组织和OASF中的4例表达IL-23p19 mRNA，且所有阳性标本的相对表达量也明显低于RA患者。这是由于OA患者滑膜组织中也存在少量的淋巴细胞、单核巨噬细胞等炎性细胞，但明显少于RA患者，炎性表现较弱，而OA滑膜成纤维细胞由于在体内受到较少的炎性细胞刺激，其表达IL-23p19 mRNA会相应地减少或减弱。

激活的嗜酸性粒细胞、树突状细胞、单核细胞和巨噬细胞能分泌前炎症细胞因子IL-1β。RA中高表达的IL-1β参与免疫反应的启动，介导关节软骨的破坏降解及骨破坏。IL-1β作为前炎症细胞因子有利于中性粒细胞在组织中的浸润，在RA免疫反应的启动中发挥重要作用。IL-1β通过抑制基质的合成在关节软骨的降解中发挥关键作用。除此之外，IL-1β在介导免疫性疾病外周组织的破坏中发挥重要作用。RA滑膜组织与RASF中两者均呈正相关，表明RA的发病过程中IL-23与IL-1β的分泌存在密切关系，IL-23很可能也通过IL-1β发挥其在RA致病中的作用。

本研究发现IL-23p19 mRNA在RA患者滑膜组织、SF中的表达量明显高于OA患者，这与两者的发病机制及滑膜炎症的病理表现不同有关。IL-23很可能是RA发病过程中重要的促炎因子之一，并且除了在滑膜组织中的单核巨噬细胞、树突状细胞等炎性细胞表达外，SF也能表达；RA滑膜组织与RASF表达的IL-23p19 mRNA与IL-1β mRNA的表达呈正相关关系表明SF分泌的IL-23也参与了RA的发病过程，除通过调节IL-17的分泌外，调节IL-1β的分泌很可能是其发挥作用的方式之一。这种致炎因子的多来源性及作用方式的多样性在RA免疫启动和放大中发挥重要作用。

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