杨克平 张云峰 李 欣

扩张型心肌病患者Th17/Treg的变化及意义

杨克平 张云峰 李 欣

本文2010-08-09收到,2010-10-08修回,2010-10-25接受

扩张型心肌病(Dilated Cardiomyopath,DCM)是一类病因不明、表现为左心或双心室异常扩大、心肌收缩功能障碍的心脏疾患。病毒感染及自身免疫反应可能是其主要原因;炎症在DCM发生发展过程中起着重要作用。过去研究表明Th1/Th2细胞失衡在急性病毒性心肌炎(Acute V iralM yocarditis,AVMC)病程中起重要作用。近来的研究发现Th17细胞及CD4+CD25+T reg细胞是一种不同于Th1和 Th2的新型CD4+T细胞亚类,二者比例失衡在动脉粥样硬化性疾病、类风湿性关节炎等慢性炎症性疾病和自身免疫性疾病的发生发展中起着重大的作用[1,2]。本文通过对AVMC患者和DCM患者外周血中Th17和CD4+CD25+Treg细胞及其分泌的细胞因子的检测分析,探讨Th17/Treg的变化及其与DCM发生发展的关系。

1 资料与方法

1.1 对象

选择我院2009年3月～2010年5月住院患者共28例,包括 AVMC 患者 12例,男 7例,女 5例,平均年龄26±8岁;DCM 患者16例,男11例,女5例,年龄42±9岁,既往均有心肌炎病史。诊断标准依据我国1999年全国心肌炎心肌病会议确定的关于成人急性病毒性心肌炎诊断参考标准和采纳世界卫生组织及国际心脏病学会联合会工作组关于心肌病定义和分类的意见及2007年颁布的心肌病诊断和治疗建议[3]。另选取我院门诊健康体检者12例对照,其中男8例,女4例,年龄40±12岁。所有对象均排除并发有肝功能和(或)肾功能不良患者,急、慢性感染,风湿性疾病3个月内有风湿活动,自身免疫性疾病患者,肿瘤患者及妊娠者,近期均未使用激素及免疫抑制剂,排除对实验结果的影响。

1.2 检测方法

1.2.1 标本的采集与处理:采清晨静脉血6 m l,肝素抗凝;一部分离心后取血清冻存于-70℃以检测白介素-17(IL-17)、转化生长因子-β1(TGF-β1),另一部分应用淋巴细胞分离液以Ficoll密度梯度法分离出外周血淋巴细胞,经含1%小牛血清的PBS洗涤后,制备淋巴细胞悬液,浓度1×109/L,用于流式细胞术检测Th17和T reg细胞。AVMC患者被采血时,心肌酶肌酸激酶同功酶及肌钙蛋白均高于正常值,表明处于急性炎症期。

1.2.2 血清IL-17、TGF-β1水平检测:取上述冻存血清,采用ELISA法检测血清中IL-17、TGF-β1水平,具体操作按试剂盒(美国Biosource公司)提供的说明书进行,每个样本和标准品均设3个复孔,酶标测试仪(MB-IV型,北京英达)450nm处读数。

1.2.3 外周血Th17细胞和CD4+CD25+T reg细胞亚群检测:取上述淋巴细胞悬液置于48孔培养板内,每孔 1m l,并加佛波酯(50μg/L)、离子霉素(1m g/L)和莫能菌素(2μmol/L)(美国e Bioscience公司),在37℃、5%CO2孵箱中培养 5h。收集细胞分为对照管和实验管,加入PE-Cy5标记的鼠抗人CD4单抗20μl(美国e Bioscience公司),混匀,室温避光放置20min对细胞表面抗原进行染色。加Cy tofix/Cy toperm液200μl,4℃放置20min,通透和固定细胞,洗涤。实验管加入FITC标记的鼠抗人CD25抗体和FITC标记的IL-17抗体(美国e Bioscience公司)各10μl,对照管加入同型对照抗体,4℃避光孵育30min后,用Perm/Wash液1m l洗涤2次,最后以300μl洗涤液重悬细胞,24h内采用流式细胞仪(FACSA ria,美国Becton Dickinson公司)检测分析。以CD4直方图设门区分 Th细胞(CD4+),最终以散点图IL-17、CD25染色阳性表示Th17细胞和Treg细胞,用Cellsquest软件获取并分析数据。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 各组外周血Th17与T reg细胞数量比较

AVMC组与DCM组Th17/Treg无显著差异,但均高于对照组(P＜0.05);AVMC组Th17高于DCM组和对照组(P＜0.05);DCM组 Treg低于AVMC组和对照组(P＜0.05)。见表1。

表1 各组患者外周血Th17、Treg细胞数量的比较(±s)

表1 各组患者外周血Th17、Treg细胞数量的比较(±s)

注:与对照组比较,1)P＜0.05;与AVMC组比较,2)P＜0.05

组 别 n Th17(%) Treg(%) Th17/T reg对照组 12 8.26±1.40 5.42±1.20 1.71±0.16 AVMC组 12 15.48±2.601) 4.83±1.10 3.88±0.941)DCM 组 16 9.12±1.502)2.38±0.601)2) 4.16±1.211)

2.2 各组炎症因子检测

AVMC组IL-17高于DCM组和对照组(P＜0.05);DCM 组TGF-β1低于AVMC组和对照组(P＜0.05)。见表2。

表2 各组患者外周血细胞因子的比较(±s)

表2 各组患者外周血细胞因子的比较(±s)

注:与对照组比较,1)P＜0.05;与AVMC组比较,2)P＜0.05

组 别 n IL-17(pg/m l) TGF-β1(pg/m l)对照组 12 248.60±118.80 231.70±105.20 AVMC组 12 410.40±127.201) 244.60±114.30 DCM 组 16 283.70±129.602) 145.30±87.401)2)

3 讨 论

DCM是一类病因不明、表现为左心或双心室异常扩大、心肌收缩功能障碍的心脏疾患。其病理改变是心肌细胞凋亡坏死和心肌纤维化引起的心室异常重构[4]。DCM发病机制不太明确,目前大多数学者认为DCM主要是慢性心肌炎的结局。临床对AVMC患者进行长期随访,发现其转变为DCM的概率显著高于一般人群,提示DCM 与AVMC可能是同一疾病的不同发病阶段[5]。炎症在DCM发生发展过程中起着重要作用。将DCM患者外周血淋巴细胞回输至重度联合免疫缺陷小鼠可以诱导与扩心病类似的严重的心脏病理改变,说明在DCM的发生过程中免疫系统介导的炎症反应起着关键的作用[6]。

过去研究认为,Th1/Th2细胞失衡在病毒性心肌炎病程中起重要作用,近来研究发现 Th17与T reg是两种不同于Th1及 Th2的新型免疫细胞,Th17作为效应性T细胞,能产生IL-17而介导炎性反应、自身免疫性疾病、肿瘤和移植排斥等的发生和发展[7]。Chang等新近研究显示,在自身免疫性心肌炎小鼠的心肌病灶中,IL-17高水平表达;抗IL-17抗体可以明显减轻自身免疫性心肌炎病变[8],这提示Th17细胞在病毒性心肌炎的炎症机制中起重要作用。CD4+CD25+T reg是一种具有免疫抑制作用的调节性T细胞,主要通过细胞接触机制或抑制性细胞因子TGF-β1发挥主动免疫抑制作用,是维持机体免疫耐受的重要调控者,它对机体中自身反应性T细胞和部分效应性 T细胞的选择性抑制能避免免疫性疾病的发生[9]。Th17/Treg失衡的发生可能触发或加剧某些自身免疫性疾病的发生,但其是否在AVMC的炎症反应及其向DCM转化的过程中发挥作用尚未见相关报道。本研究显示AVMC组及DCM组患者外周血Th17/Treg明显较对照组高,提示免疫平衡被打破,促进了AVMC的发病及其向DCM的发展。在AVMC患者外周血中,Th17及IL-17均高于DCM组及对照组,说明在病毒性心肌炎发病早期,Th17及其分泌的IL-17介导了心肌急性炎症反应,造成了心肌细胞损伤;而在DCM患者外周血中,Th17及 IL-17较正常人无明显变化,而T reg及其分泌的TGF-β1均低于AVMC组和对照组,说明因具有抑制性作用的T细胞减少引起的慢性炎症促进了心肌细胞的凋亡坏死和心肌纤维化的形成。

本研究结果显示AVMC及DCM的炎症反应形式及参与的炎症细胞及因子均有所不同。Th17/T reg的升高可能促进了AVMC的炎症反应及其向DCM的转化。尽管Th17/Treg均表现升高,但在AVMC患者中是因分子 Th17升高而升高,而在DCM患者中是因分母变小而升高。这种炎症反应形式的改变机制尚不清楚,切断这种机制也许能阻止AVMC向DCM的转变,积极改善AVMC患者的远期预后。

本文第一作者简介:

杨克平(1977～),男,汉族,主治医师,硕士,从事心脏病炎症机制研究

1 Cheng X,Yu X,Ding YJ,et al.The Th17/T reg imbalance in patients with acute coronary syndrome.C lin Immunol,2008,127(1):89～97.

2 中华医学会心血管病学分会,中华心血管病杂志编辑委员会.中国心肌病诊断与治疗建议工作组.心肌病诊断与治疗建议,中华心血管病杂志,2007,35(1):5～16。

3 Boissier MC,A ssier E,Falgarone G,et al.Shifting the imbalan ce from Th1/Th2 to Th17/T reg:the changing rheumatoid arthritis paradigm.Joint Bone Spine,2008,75(4):373～375.

4 H eineke J,Molken tin JD.Regu lation of cardiac hypertrophy by intracellular signailing pathways.Nat Rev M ol Cell Biol,2006,7(8):589～600.

5 Liu PP,M ason JW.Advances in the understanding ofmyocarditis.Circulation,2001,104(9):1 076～1 082.

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8 Chang H,H anaw a H,Yoshida T,et a1.A lteration of IL-17 related protein expressions in experim ental autoimmune myocarditis and inhibition of IL-17 by IL-10-Ig fusion gene transfer.Circ J,2008,72(5):813～819.

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扩张型心肌病患者Th17/Treg的变化及意义

杨克平,张云峰,李 欣/华中科技大学同济医学院附属荆州中心医院心内科,荆州434020

目的:探讨 Th17/Treg的变化及其与扩张型心肌病(DCM)发生发展的关系。方法:收集急性病毒性心肌炎(AVMC)患者及DCM患者和健康体检者的外周血,EL ISA法检测血清中IL-17及 TGF-β1浓度;经PE-CD4、FITCCD25及FITC-IL-17单抗染色后,双色流式细胞术检测 Th17细胞及 T reg细胞的比例。结果:AVMC组Th17和 IL-17高于DCM组和对照组;DCM组T reg和TGF-β1低于AVMC组与对照组;AVMC组与DCM组 Th17/T reg无显著差异,但均高于对照组。结论:Th l7/T reg的升高打破了免疫平衡,促进了AVMC的发病及其向DCM的发展。

The Change of Th17/Treg in Patients with Dilated Cardiomyopathy and Its Significance

Yang Keping,Zhang Yunfeng,Li Xin/Department of Cardiology,Jingzhou Central Hospital,A ffiliated to Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology,Jingzhou 434020

Dilated cardiomyopathy;Acute viral myocarditis;Th17 cells;Treg cell

R542.2

A

1005-1740(2011)01-0032-03

华中科技大学同济医学院附属荆州中心医院心内科,邮政编码 荆州434020

book=34,ebook=211

Objective:To investigate the change of Th l7/T reg in peripheral blood and its relation with pathogenesis of dilated cardiomyopathy(DCM).M ethod:Blood w as collected from patien ts with acu te viral myo-carditis(AVMC)or DCM and healthy people.Th l7 and Treg subsets in peripheral blood w ere detected by bicolo r flow cytometry after stained with PE-CD4,FITC-CD 25 and FITC-IL-17 mAb.ELISA method wasused formeasuring the levelsof related cy tokines IL-17 and TGF-β1.Results:Both Th17 cell and the level of related cytokine IL-17 in AVM C group were higher than DCM and healthy group.The proportion of Treg cell and the levelof TGF-β1 in DCM group w ere low er than AVMC and healthy group.Th17/Treg between AVMC group and DCM group had no significant differencebut w ere higher than healthy group.Conclusion:The rise of Th17/Treg disrupted the balance of immunity and contributed to the onset of AVMC and the developm en t of DCM.

扩张型心肌病 急性病毒性心肌炎 Th17细胞 T reg细胞