魏中南 夏剑波

乙型肝炎病毒前S2基因克隆及真核表达载体的构建

魏中南 夏剑波

本文2010-07-13收到,2010-09-2修回,2010-12-10接受

乙型肝炎病毒(Hepatitis B V rus,HBV)前S2蛋白位于病毒体的表面,在病毒与宿主肝细胞结合过程中起重要作用。前S2蛋白有反式激活作用,可能与肝细胞癌的发生发展有关[1]。此外,前S2蛋白还可作为反映HBV复制的指标之一[2]。研究HBV前S2基因的生物学作用,有助于寻找预防和治疗乙型肝炎的最佳方法以及明确其在临床诊断中的意义。为了能进一步研究前S2蛋白的生物学功能,本文构建了表达HBV前S2蛋白的真核质粒。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂

PTC-200型PCR扩增仪为美国M J公司生产;凝胶成像系统为美国UVP公司提供;限制性内切酶EcoRⅤ和BamHⅠ、高保真 Prime STAR HS DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、凝胶回收试剂盒及质粒小量提取试剂盒均为日本 TaKaRa公司产品;DNA分子量标准DL2000和1kb DNA Ladder购自上海天根公司;引物合成及DNA测序均由上海英骏公司完成。

1.2 载体与菌株

真核载体pcDNA 3.1(+)和大肠杆菌DH 5α均为本科室保存。

1.3 血清HBV DNA抽提

采集1例HBV DNA阳性慢性乙型肝炎患者静脉血,离心后取 100μl血清,直接煮沸法提取DNA,取5μl处理上清作为PCR扩增模板。

1.4 引物设计、合成及PCR扩增

参照 Genbank中 HBV基因(AF100309.1、HM 153811.1、AF461043.1、AY066028.1 和AF533983.1)前S2区的序列,分别设计上游引物:5'-A TAGGATCCCTCAGGCCATGCAGTG-3';下游引物:5'-CCCGATATCGGGTT(T/C)AAATGTAT(A/G)CCCA-3',上下游引物5'端分别引入Bam H I和EcoRⅤ酶切位点。PCR反应体系为50μl:5×Prime STAR反应缓冲液(含M g2+)10μl、10mmol/L dNTP 4μl、10μm ol/L 上下游引物各 1μl,HS DNA Polym erase 0.5μl,模板 5μl,加水至50μl。PCR 反应条件为:95℃3m in,随后 98℃10s,58℃15s,72℃60s,共 30个循环;最后72℃延伸5m in。

1.5 重组质粒的构建及鉴定

对回收纯化的PCR产物和载体pcDNA 3.1(+)分别用Bam HI和EcoRⅤ进行双酶切并纯化。然后将两者混合后加入T4 DNA连接酶连接过夜。连接产物转化DH5α,涂布于LB(Amp+)平板。培养16h后挑取单菌落扩增,取PCR鉴定正确的重组菌,小量制备质粒作酶切鉴定,再送上海英骏公司测序。质粒的提取、酶切、连接及转化等均按试剂盒说明书进行。

2 结 果

2.1 PCR扩增目的基因

患者血清经PCR扩增后,经1.5%琼脂糖凝胶电泳,在约860bp处可见一条特异的条带,与HBV前S2基因大小一致,如图1所示。

2.2 阳性重组质粒的酶切鉴定

取重组菌提取质粒,经EcoRⅤ单酶、BamH I和EcoRⅤ双酶切后经1.0%琼脂糖凝胶电泳,得到的片段均与预期一致,如图2所示。

2.3 重组质粒测序结果

测序后通过序列比对,真核质粒中插入的前S2目的片段为858bp,其读码框正确,确认已成功构建HBV前S2真核表达质粒。

3 讨 论

由于前S2外膜蛋白上存在人血清白蛋白结合位点,与HBV嗜肝性及入侵肝细胞有关;同时,前S2外膜蛋白具有类似于HBx蛋白的反式激活作用,主要依赖于前S2蛋白羧基末端,与肝细胞癌的发生发展密切相关[3,4]。因此,前S2蛋白在临床诊断中具有独特的价值,可作为反映HBV复制的指标之一,是判断乙型肝炎病毒感染及病情进展和预后的一项可靠指标。研究表明,在急性乙型肝炎早期,前S2抗原与HBeAg、HBV DNA均可被检出,在恢复期前S2抗原早于HBeAg转阴。另有报道,前S2抗原与 HBsA g含量呈正相关,与 HBeA g、HBV DNA有良好的伴随关系,可作为一项良好的判断乙型肝炎病毒感染及病情严重程度的指标[2]。

HBV在感染者体内是以准种的形式存在,在宿主免疫压力下,前S2基因某些位点可发生突变[5]。因此在克隆HBV前S2基因时,根据中国HBV流行株的序列设计了兼并引物,以保证扩增成功。另外,由于扩增的产物约为860bp,为防止在PCR反应时出现碱基突变,我们使用了具有高保真和高效扩增能力DNA聚合酶。实验结果表明,成功地克隆出HBV前S2基因并构建了表达完整HBV前S2蛋白的真核质粒,为进一步研究前S2蛋白的生物学作用和其诊断意义提供了条件。

本文第一作者简介:

魏中南(1956～),男,汉族,副主任技师

1 Luan F,Liu H,Gao L,et al.H epatitis B virus protein preS2 poten tially promotes HCC developmen t via its transcriptional activation of hTERT.Gu t,2009,58(11):1 528～1 537.

2 王 卉,詹喜焱.前S1、S2抗原在诊断乙肝病毒复制时的临床意义.临床血液学杂志,2008,21(2):192～194.

3 H ildt E,Munz B,Saher G,et al.The PreS2 activator MH Bs(t)of hepatitis B virus activates c-raf-1/Erk2 signaling in transgenic m ice.EMBO J,2002,21(4):525～535.

4 Hildt E,H ofschneider PH.The PreS2 activators of the hepatitis B virus:activato rs of tumour promoter pathw ays.Recen t Results Cancer Res,1998,154(8):315～329.

5 Harrison TJ.Hepatitis B virus:m olecular virology and common m utan ts.Sem in Liver Dis,2006,26(2):87～96.

乙型肝炎病毒前S2基因克隆及真核表达载体的构建

魏中南,夏剑波/湖北省妇幼保健院检验科,武汉 430070

目的:克隆乙型肝炎病毒前S2基因,构建其真核表达质粒。方法:以乙型肝炎患者血清HBV DNA为模板,设计引物扩增全长前S2基因,再将目的基因插入到真核载体 pcDNA 3.1(+)中,经PCR、酶切和 DNA测序确认。结果:从患者血清抽提的DNA中扩增得到约860bp大小的目的片段,经回收、纯化、酶切后转化大肠杆菌DH 5α,阳性重组质粒经PCR扩增得到约860bp产物;重组质粒经Bam HⅠ和EcoRⅤ双酶切得到5.4kb和860bp两个片段,与预期一致;经DNA测序与已知序列比对确认前S2基因片段正确插入pcDNA3.1(+)载体。结论:成功构建了含前S2基因的真核载体,为进一步研究HBV前S2蛋白的生物学功能及其实验诊断意义提供了条件。

Cloning of Hepatitis B Virus PreS2 Gene and Construc tion of Eukaryotic Expression Vec tor

Hepatitis B virus;PreS2 gene;Clone;Eukaryotic expression

R373.2+1

A

1005-1740(2011)01-0019-02

湖北省妇幼保健院检验科,邮政编码 武汉 430070;

夏剑波,E-m ail:xjb915@126.com

Objective:To c lone HBV preS2 geneand construct an eukaryotic ex pressive vector pcDNA-S2.Method:HBV p reS2 gene w as amplified by PCR from serum of a chronic HBV carrier,and cloned into the eukaryotic vector pcDNA 3.1(+),then authenticated by PCR,digestive enzym es and sequencing.Results:A 860bp fragment of the preS2 gene w as successfu lly am plified by PCR from the serum,and inserted in to the eukaryotic vector pcDNA 3.1(+).The positive clonew as identified by PCR,enzym edigestion and DNA sequencing.Conclusion:Eukaryotic expression vector pcDNA-S2 w as successfully constructed,which provides a tool for further studies on its biological function and fu rther investigation of its roles in HBV diagnosis.

乙型肝炎病毒 前S2基因 克隆 真核表达Wei Zhongnan,Xia Jianbo/Department of Clinical Laboratory,H ubeiM aternal and Child Health Hospital,W uhan 430070