蒋小武

（西南大学荣昌校区，重庆 402460）

浅析氟喹诺酮类兽药残留检测方法

蒋小武

（西南大学荣昌校区，重庆 402460）

解决兽药残留监控问题是提高动物源性食品质量，保障食品安全的关键性环节之一，因此在食品检验中建立一些方便快捷的检测方法显得尤为重要。本文以兽药氟喹诺酮类为例，系统阐述了目前在临床检测中已经建立的有关氟喹诺酮类药物残留的检测技术，以期能为其他药物残留检测提供参考方向。

氟喹诺酮类 药物 残留 检测方法

1 引言

据2010～2011年度中国全面小康研究中心给出的《消费者食品安全信心报告》结果显示，近7成调查报告受访者对食品“没有安全感”[1]，食品安全在公民最担心的5大安全问题中“独占鳌头”。民以食为天，食以安为先，食品安全问题因关系到人的健康和安全而受到各国政府和全社会的高度重视，已成为全球关注的焦点，而农药、兽药的滥用造成在食品中残留量过高的问题十分突出，是影响食品安全的最重要的化学性因素之一。随着养殖业的迅速发展，兽药的使用范围不断扩大，用量不断增加。药物的应用在提高动物产品产量的同时，食品中造成了极为严重的兽药残留，特别是不遵守休药期规定、超量使用或非法使用违禁药物常常导致严重后果。兽药残留不仅危及人体健康，主要表现为变态反应、细菌耐药性、三致作用（致癌、致畸、致突变）等，还严重着影响我国动物性食品的出口，给畜牧业经济造成了极大的负面影响，由此造成的损失和损害已引起了公众的普遍关注[2-3]，为此，建立一套完整的兽药残留检测体系显得十分必要。

2 氟喹诺酮类药物概述

氟喹诺酮类（Fluoroquinolones，FQs）药物是喹诺酮类药物的第3代产品，它代指一族人工合成的具有6-氟-4-喹诺酮环基结构的广谱杀菌性抗菌剂，对革兰氏阳性菌和阴性菌、支原体、某些厌氧菌均有效，主要通过抑制细菌DNA螺旋酶作用，阻碍DNA合成而导致细菌死亡[4]。因其抗菌谱广、抗菌活性强、与其他抗菌药物无交叉耐药性、毒副作用小，半衰期长、具有抗菌药后效应等特点而被广泛用于动物和人类的多种感染性疾病的治疗[5-6]。任何药物都有副作用，氟喹诺酮类药物也不例外[7]。随着FQs在动物中的广泛应用，常常有不合理用药和滥用药情况发生，残留在人和动物的粪便和尿液等排泄物中的药物不断进入环境，在新的选择压力下，环境细菌的耐药性越来越普遍[8]。由于FQs药物的不良反应主要发生在人类，动物则反应不大，但动物用药后的药物残留可以通过食物链传播，同样会引起人类不良反应现象的发生[9]，除了其毒副作用等对人产生直接危害外，更为严重的是动物性食品中残留较低浓度的药物容易诱导人类致病菌产生耐药性，使易感人群产生过敏反应、激素障碍变态反应等[10-11]，从而不利于该类药物在人类疾病的治疗。为此，对动物体内FQs的残留检测已越来越引起了人们的广泛关注。

3 氟喹诺酮类药物残留的检测方法

目前，常用于氟喹诺酮类药物残留的检测方法可分为4大类：微生物法、仪器分析法、化学发光与电化学发光分析法及免疫分析法。其中仪器分析法常见的有高效液相色谱法（HPLC）、液-质联用分析法（LC/MS）、高效毛细管电泳法（HPCE）等；免疫分析检测法包括间接竞争Elisa测定法、免疫传感器分析法、免疫亲和色谱（IAC）分析法等[12]。

3.1 微生物法

微生物法是应用最早而广泛的方法，适用于对畜禽组织中的抗菌药物进行

快速筛选检验。其测定原理是根据抗生素对微生物的生理机能、代谢的抑制作用来定性或定量地检测确定样品中抗生素的残留[10]。该法虽然能检测高浓度的药物残留，操作相对简单，所需费用成本低，能适用于大量样品的快速筛选检测[13]，但通常的检测限高于样品所规定的最大残留限量[7][12]，而且灵敏度较低、特异性不强[14]，耗时较长。

据刑应寿[15]等报道，环丙沙星在磷酸盐缓冲液、肌肉、肝脏和肾脏中的最低检测限分别为0.025 μg/ml、0.05 μg/g和0.075 μg/g，该方法灵敏度和回收率高，操作简便，不需特殊设备，样品用量少，易于推广，适于环丙沙星的定量检测；Okernman[16]等报道了利用改良的欧洲四平皿法检测市售肉品中的恩诺沙星和环丙沙星残留，但该法的检测限高于欧盟所规定的MRL；陈曦[11]等以金葡菌为工作菌，发现利血平增敏法可使恩诺沙星最低检测限由0.125μg/ml降低到0.0156μg/ml，提高了灵敏度；沈翠香[17]等通过微生物抑制法在培养基中添加适量已知浓度的恩诺沙星来提高敏感菌的敏感度，利用红四氮唑显色，检测恩诺沙星的残留，其检测限从50 μg/kg降到10 μg/kg；郑晶[18]等比较了用微生物法与酶联免疫分析法检测氟喹诺酮类药物的残留，结果显示微生物法更适合这类药物的检测；胡鲲[19]等用微生物显色法测定水产品中恩诺沙星残留最低检测限可达50μg/kg，适合与生产、销售、流通等非实验室条件下作为初筛方法使用。

3.2 仪器分析法

3.2.1 高效液相色谱法（HPLC） HPLC是在经典的液相色谱法基础上发展起来的，通过引入高分离效能的色谱柱和高灵敏度的紫外线检测器或荧光检测器，发展了气相色谱的理论和技术，特别适用于高沸点、大分子、极性强和热稳定性差的化合物的分析。目前HPLC法广泛应用于检验检疫机构、科研单位、养殖加工企业[20]，残留检测多以此法为国家标准（GB），它具有气相层析的全部优点，分离能力强、灵敏度高、可在室温下进、应用范围极广[7，13]，是目前最常用的检测方法。

张鑫[21]等用缓冲盐溶液提取，C18固相萃取小柱净化，高效液相色谱-荧光检测器同时检测畜禽肉蛋及水产中4种FQs药物，其中环丙沙星、恩诺沙星、沙拉沙星定量限皆为10 ng/ g，达氟沙星定量限为2 ng/g，回收率在70%～93%之间；刘俊华[22]等同样应用此法检测鸡肉中四种氟喹诺酮类药物残留，结果氧氟沙星在0.003～0.6μg/g范围内呈良好的线性关系，而诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星在0.001～0.2μg/g范围内呈良好的线性关系，样本平均加标回收率在56%～105%之间；李丹[23]等对鸡蛋中4种FQs药物残留量检测，结果表明，4种氟喹诺酮类药物环丙沙星、恩诺沙星、沙拉沙星在2～500 ng/mL范围内峰面积与浓度呈良好的线性关系，定量限均为10 μg/ kg，达氟沙星的定量限为2 μg/kg；孙焕[24]等运用反相高效液相色谱法对猪肉组织中恩诺沙星和环丙沙星残留量进行检测，结果环丙沙星、恩诺沙星的质量浓度在2 g/L～100 g/L范围内呈线性关系，它们的最低定量限均为2g/kg。

3.2.2 高效液相色谱-质谱联用法（LC-MS） 随着研究的深入和对食品安全越来越高的重视，定性准确，灵敏度更高的液质联用技术渐渐被人们采纳，这种技术不仅可以更精确的进行定量分析，避免了以往因为检测手段达不到国外要求而遭遇的贸易壁垒，而且可准确定性，大大减少液相色谱法中出现的杂峰干扰现象，喹诺酮类药物定量限可达到5 ng/mL，检测限在1ng/mL[25]，灵敏度高，能方便地对微量兽药残留组分进行检测，是目前检测食品中FQNs残留确证检测的最佳方法之一，但该方法的缺点是仪器较为昂贵[13]，目前还难以普及。

黄优生[26]等则用用酸性乙腈提取鱼肉中的4种氟喹诺酮药物残留，然后用正己烷脱脂，氮吹浓缩定容后，用反相液相色谱分离，以液相色谱-串联质谱仪测定，外标法定量，结果4种FQs药物的线性范围为2～40μg/kg，检出限为0.1～0.4μg/kg，定量限为0.3～1.0μg/kg；Schneider[27]等利用LC-MS法检测鸡肝脏和肌肉组织中8种FQs类药物的残留，该方法的检测限（肝脏/肌肉ng/g）分别为：脱乙烯环丙沙星（0.3/0.1），诺氟沙星（1.2/0.2），环丙沙星（2.0/1.5）、达氟沙星为（0.2/0.1）、恩诺沙星（0.3/0.2），奥比沙星（1.5/0.5）、沙拉沙星（2.0/0.6）和二氟沙星（0.3/0.2），回收率为60%～93%；武艳如[28]等测定牛肉中3种氟喹诺酮药物（环丙沙星、恩诺沙星和沙拉沙星）残留，发现在1～20 pg/μL范围内3种FQs药物的线性相关系数均大于0.992，检出限为8～19μg/kg，回收率75.2%～96.3%；孙雷[29]等对猪肉组织中7种氟喹诺酮类药物（氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、达氟沙星、二氟沙星和沙拉沙星）残留检测显示了7种FQs药物在5-250ng/mL浓度范围内呈现良好线性关系，方法检测限为5ng/g，定量限10ng/g，平均回收率为80.7%～116%。

3.2.3 高效毛细管电泳法（HPCE） 高效毛细管电泳法是近年发展起来的新技术，与常用的HPLC法相比，它不受运行缓冲液的酸、碱性和其中的表面活性剂等添加剂的影响，具有样品用量少、分析速度快、分离效率高、运行成本低、适用范围广等特点[7]，有利于实际样品的分析，也是一种常用的药物残留检测手段。近年来，随着前处理技术的进步以及方法自身的改善，现在此法已经可以对某些药物进行检测[20]。

李慧[30]等以毛细管电泳建立了同时检测雏鸡、哺乳猪等饲料中5种氟喹诺酮类药物的方法，在274 nm处，分离电压为18 kV，分离温度为22 ℃，在80 mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠pH为6.5的运行缓冲液下，5种药物可在10 min内完全分离，方法的平均回收率为84.42%～107.5%，精密度为1.36%～1.69%，回收率和精密度能够满足对这5种药物的检测要求；Hernandez[31]等应用毛细管等速电泳-毛细管区带电泳检技术测猪血清中的环丙沙星、恩诺沙星和氟甲喹，其检出限分别为70、85和50 μg/L，该方法简单灵敏，可作为HPLC的一种替代方法；刘娜[32]等用HPCE法测定复方乳酸环丙沙星注射液中环丙沙星和利巴韦林，结果它们的的校准曲线在5 mg/L～100 mg/L内呈良好的线性关系，复方乳酸环丙沙星回收率97.2%～110%；Barron[33]等结合固相萃取技术，进行鸡肉中双氟沙星和沙拉沙星的检测，定量限分别可达到25ng/mL、50ng/ml。

3.3 化学发光与电化学发光分析法

化学发光分析法（CL）是借助反应物或生成物吸收化学反应释放的化学能由基态跃迁至电子激发态，再由电子激发态的最低振动能级返回基态时所产生的光辐射来进行分析的方法。该法反应装置简单，不需要复杂昂贵的分光系统，检测灵敏度高、光学系统简单、信号背景低、可与高效分离方法联用，同时满足了分析的灵敏度和选择性要求，有利于复杂样品的定性定量分析，目前它已广泛用于不同药物的分析研究[34-35]。常见的CL有敏化化学发光法、紫外分光光度法和荧光法等。如贾丽华[36]等研究了恩诺沙星在胶束体系中的荧光特性，发现十二烷基硫酸钠对恩诺沙星有较强的增敏作用，由此建立了胶束增敏荧光光谱法测定恩诺沙星线性范围为0～0.64μg/mL，检出限为4.75 ng/mL；孙汉文[37]等建立了流动注射化学发光检测恩诺沙星，结果显示在3×10-7～3×10-6g/mL范围内，化学发光强度与恩诺沙星的浓度之间呈现良好的线性关系，检出限为1.1×10-7g/mL；周华[38]等则运用环丙沙星对NaOH介质中的鲁米诺-铁氰化钾的化学发光具有较强的增敏作用而建立起环丙沙星药物的流动注射化学发光法且测得其检出限1.2×10-6g/L；陈玉海[39]等建立了溴甲酚绿萃取分光光度法测定恩诺沙星在0.25～4.0mg/L范围内服从比耳定律，方法检出限为49.2μg/L。

电化学发光（ECL）分析法是将化学发光分析法与电化学手段相结合的一种新的分析技术。它具备化学发光的高灵敏度、宽线性范围、仪器简单、重现性好的优点外，还有效克服了化学发光选择性差的缺点，具有灵敏度高、选择性好、操作简便、易于控制、并且实验中的一些试剂可重复使用等优点，是近年来分析技术中一种重要的检测手段，受到了人们的特别关注[34]。常见的ECL有胶束电动毛细管电泳法、示波极谱法和吸附溶出伏安法等。如孟勇[40]等应用反相高效液相色谱法配二极管阵列检测器，建立并测定中华绒螯蟹肝脏中诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星残留量的方法，结果表明，该方法线性关系和重复性良好，样品中3种FQs药物残留的回收率在73.26%～85.82%，最低检测限为10μg/kg。

3.4 免疫分析法

免疫分析技术是以抗原-抗体的特异性、可逆性结合为基础的新型分析技术[6]。其原理是使用特定的抗体（由于兽药的分子量都小于5000，是半抗原，需与大分子物质如HAS、BSA和KLH等载体联接，形成免疫原，以此来制备针对单一药物的高特异性抗体或针对某一类药物的抗体）识别目标药物，目标药物和标记药物互相竞争性地与特异性抗体进行结合，形成药物抗体复合物，通过复合物和酶结合显示的颜色或底物的颜色来进行分析[41-42]。依据标记物的不同可将免疫测定法分为酶标记法、荧光标记法、胶体金标记法等。

由于免疫分析法不仅具有特异性高，准确性好、方法简单、灵敏度高，还可用于大批量样品的快速检测等特点[14]，因此它的发展非常快，在食品安全检测中的研究和应用越来越多。如Duan[43]等用碳二亚胺法制备了环丙沙星的多克隆抗体，建立了环丙沙星的间接竞争ELISA法，结果检测限为0.32 ng/ml，环丙沙星在猪肉、鸡肉及牛乳中回收率分别为75.58%、81.20%和84.50%；赵银丽[44]等采用混合酸酐法将恩诺沙星分别与BSA和卵清白蛋白偶联制备免疫抗原和包被抗原，将免疫原免疫家兔，制备多克隆抗体，再应用其研制恩诺沙星残留阻断ELISA快速检测法，结果阻断ELISA的线性检测范围为1～205ng/mL，灵敏度为1ng/mL，鸡肉样的平均添加回收率分别为87.35%；魏东[45]等以沙拉沙星为半抗原，BSA偶联后免疫兔，获得对多种氟喹酮类药物（诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星）有特异性的广谱性抗体，并以沙拉沙星与卵清白蛋白的偶联物作为包被原，建立优化了间接竞争ELISA检测方法，结果沙拉沙星最低检出限为19.319μg/L，诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星最低检测限分别是22.646、26.181和19.054μg/L；陈雪岚[46]等采用丙基碳化二亚胺盐酸-NHS法制备恩诺沙星-BSA免疫原和恩诺沙星-OVA检测抗原，并建立了间接竞争ELISA法测得恩诺沙星残留检测限为1 ng/mL，线性范围在1～100ng/mL之间；Mellgren[47]等研制了能检测牛乳汁中恩诺沙星及其代谢产物的表面等离子共振免疫传感器，该方法的恩诺沙星检测限为1.5 ng/ml。

4 前景展望

目前国内对氟喹诺酮类药物残留的检测主要还是单物质的检测，也有少数针对多物质残留的检测[7]。微生物法适用于残留量明显的药物快速筛选；色谱仪器法虽具有高效、快速、灵敏、准确等特点，但样品前处理比较繁琐，所需仪器也比较昂贵，不适合大量样品的快速检测；免疫分析将最有可能取代色谱仪器分析成为此类药物最常用的方法[12，41]，另外将各种分析技术联用，可以使各种分析技术取长补短，获得单一分析技术难以达到的效果，这将会成为以后残留检测的一个发展方向。

目前，我国兽药应用十分广泛，虽然兽药残留量很低，但对人体健康的潜在危害却相当严重[3，48]。因此，完善兽药残留的检测方法，特别是快速筛选和确认的方法，加大筛选兽药残留的立法和方法标准化等方面的国际交流与合作，使我国的兽药残留监控与国际接轨，对于促进我国畜牧业的发展，保障食品安全，维护国民体质与健康具有重要意义。

（略）

[1] 欧阳海燕.2010-2011年消费者食品安全信心报告[J].小康，2011（1）

[2] 齐伶俐，井玉香，马 林，等.动物产品兽药残留产生的原因及防控措施[J].中国食物与营养，2006（11）：17～18

[3] 张彦明，佘锐萍.动物性食品卫生学书[M].第四版.北京：中国农业出版社，2009

[4] 陈杖榴.兽医药理书[M].第三版.北京：中国农业出版社，2009