乌仁塔娜 刘 芳 白振中 嘎 琴 格日力

（青海大学医学院高原医学研究中心，青海 西宁 810001）

EPAS1是哺乳动物机体功能在缺氧条件下的重要氧依赖转录激活因子。其蛋白属于bHLH-PAS转录因子家族成员，由氧敏感的α亚基和核内稳定表达的β亚基以异源二聚体形式存在。近来越来越多的研究发现，EPAS1参与诸多低氧有关的下游基因的表达调控，从而在低氧调控机制中发挥重要作用[1,2]。因此结合我们正在开展的有关低氧获得性习服相关的研究，对青藏高原获得性习服物种藏系绵羊EPAS1的基因进行了克隆及序列分析，以便为进一步研究高原获得性习服以及急慢性高原病的发病机制的研究提供资料。

1 材料与方法

1.1 材料来源

2009年4月在青海省可可西里国家级自然保护区（海拔4300m）捕获雄性藏系绵羊10只，捕捉后立即运至格尔木市（海拔2800m）解剖取藏系绵羊各组织，迅速投入液氮容器中，低温保存并运回西宁。

1.2 方法

1.2.1 总RNA提取及鉴定

按照Trizol试剂盒说明提取藏系绵羊肺组织总RNA，溶于20μL DEPC水中，并用DU800核酸蛋白含量检测仪测定A260/A280值及浓度，并进行1%甲醛变性凝胶电泳检测其质量，置-80℃冰箱保存备用。

1.2.2 目的基因扩增及序列测定

引物设计：利用GenBank中人、小鼠、大鼠、牛和牦牛的EPAS1 cDNA序列用ClustalW进行同源性对比。

目的基因的扩增：取总RNA 2.0μg，按照AMV逆转录酶试剂盒逆转录合成cDNA第一链。PCR反应体系：模板cDNA 1μL，PCR Master Mix 15μL，EPAS1上下游引物各1μL，加水补足至25μL；扩增条件为：95℃预变性5min后进行35个循环，每循环95℃ 30s，55℃ 1min，72℃ 1min，循环结束后72℃延伸10min。取PCR产物10μL 进行1.2%的琼脂糖凝胶电泳，采用紫外凝胶成像分析系统记录电泳结果。……