一种新的草甘膦抗性机制
——基因复增

编者按《PNAS》杂志上发表了美国科学家Todd A.Gaines等对从美国乔治亚州获得的具有草甘膦抗性的红根苋(Amaranthuspolmeri)研究中，发现其获得草甘膦抗性是通过一种全新的基因复增机制。这一发现对草甘膦这一全球最重要的除草剂的持续使用以及向作物转草甘膦抗性基因技术的持续使用将产生重要影响。本刊特请南京农业大学杂草研究室毛婵娟硕士摘要译出该文，以供广大杂草科学工作者参考。

草甘膦是一种广谱、茎叶处理、内吸传导型的灭生性除草剂。自抗草甘膦转基因作物商业化以来，草甘膦的使用量持续增加，目前已占到整个除草剂市场的20%以上。草甘膦的大量使用对杂草种群造成了巨大的选择压力。美国科学家Todd A. Gaines等对从美国乔治亚州获得的具有草甘膦抗性的红根苋(Amaranthuspalmeri)进行了研究，发现其获得草甘膦抗性是通过一种全新的基因复增机制。这一结果发表在《PNAS》杂志上。

草甘膦的分子靶标是叶绿体靶标酶5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)，它是莽草酸途径的组成酶。具有草甘膦抗性的杂草种群的抗性机制是降低草甘膦的传导或者EPSPS基因靶标位点发生突变。在小白酒草和黑麦草中普遍的抗性机制为降低草甘膦的传导，这种机制所产生的抗性比EPSPS基因靶标位点突变所产生的抗性高7～11倍。在牛筋草、黑麦草以及一年生黑麦草中，EPSPS基因106位的脯氨酸发生突变，这种基因突变所产生的2～3倍的抗性已经足以使得杂草种群在草甘膦使用地区得以延续。目前，在草甘膦抗性杂草中增加EPSPS基因的表达量还没有被证实作为一种草甘膦抗性机制。

Todd A. Gaines等研究发现，在一些杂草种群中EPSPS基因靶标位置突变可以产生2～3倍的草甘膦抗性，而在乔治亚州红根苋中，通过PCR扩增获得了草甘膦抗型和敏感型的红根苋EPSPS cDNA的序列全长，进行序列分析，其106位的脯氨酸没有发生突变。用0.4 kg/hm2的草甘膦对抗型和敏感型的红根苋进行处理，8 h后，敏感型红根苋出现了莽草酸的积累而抗型的没有。采用定量RT-PCR检测EPSPS基因的表达水平，参照基因为ALS，发现抗型红根苋的EPSPS基因表达量比敏感型种群高出35倍。通过定量PCR发现，敏感型种群相对于ALS的基因拷贝数为1～1.3(n=12)，而抗型种群的EPSPS基因相对拷贝数为5～160(n=12)。拟F2种群对0.4 kg/hm2的草甘膦具有抗性。在拟F2种群中，EPSPS基因拷贝数与草甘膦抗性产生共分离现象。其中增加EPSPS基因相对拷贝数的个体在250 μmol/L草甘膦处理下不产生莽草酸的积累，说明在这浓度下对草甘膦具有抗性。拟F2中仅有1个EPSPS基因拷贝数的个体都产生了莽草酸的大量积累，说明它们对草甘膦敏感。采用定量RT-PCR对拟F2种群的EPSPS基因表达量进行测定，发现EPSPS与ALS基因拷贝数之比为1 ∶1的植株，EPSPS与ALS基因表达量也约为1 ∶1，EPSPS基因表达量随着EPSPS基因拷贝数的增加而增加，且两者之间存在显著的相关性。通过免疫印迹法测定EPSPS蛋白表达量，在抗型、敏感型以及拟F2种群中，EPSPS信号强度与EPSPS基因组拷贝数存在显著正相关。对EPSPS进行酶活测定，拟F2种群中的敏感型植株的EPSPS酶活远低于抗型植株。EPSPS拷贝数大于1的样品的IC50值与EPSPS拷贝数为1的样品间不存在显著性差异，说明草甘膦能同样抑制抗性植株与敏感型植株体内的EPSPS酶活。通过原位杂交(FISH)确定复增的EPSPS基因在染色体上的定位与分布，观察到FISH信号在抗性个体的整个基因组中都有分布，这表明复增的EPSPS基因是随机地插入到红根苋的基因组中。抗性植株的EPSPS基因平均拷贝数为77±14(n=12)。

Gaines等的研究结果表明，红根苋获得草甘膦抗性的机制是多条染色体上EPSPS基因多拷贝复增。EPSPS基因复增导致EPSPS基因的表达量、EPSPS酶的活性大大增加，从而对草甘膦产生抗性。基因复增是在自然发生的杂草种群中产生的，这是一种新的杂草对草甘膦产生抗性的机制，对草甘膦这一全球最重要的除草剂的持续使用以及向作物转草甘膦抗性基因技术的持续使用产生了威胁。

毛婵娟(南京农业大学 杂草研究室)摘译自Todd A. Gaines，et al. Gene amplification confers glyphosate resistance inAmaranthuspalmeri[J]. PNAS,2010,107:1029-1034.