李春丽，韩露，郑振宇，赵卫东

河南农业大学牧医工程学院，郑州 450002

植物甜蛋白des-pGlu1-Brazzein的密码子优化及其在毕氏酵母中的表达

李春丽，韩露，郑振宇，赵卫东

河南农业大学牧医工程学院，郑州 450002

根据甜蛋白des-pGlu1-Brazzein的成熟区氨基酸序列，按照酵母密码子的偏好优化其编码序列，合成了4对末端具粘合位点的寡聚核苷酸序列，经连接、PCR扩增后得到了179 bp的des-pGlu1-Brazzein编码序列，插入到pPIC9K载体中，构建了重组表达载体pPIC9K-Bra。经酶切、电击转化到毕赤酵母菌GS115中。酵母工程菌株经筛选鉴定后诱导表达，目的蛋白的表达量约占上清总蛋白的51.6%，分离纯化后的des-pGlu1-Brazzein具有一定的甜度。

甜蛋白，毕氏酵母，表达，活性检测

然而天然甜蛋白的开发生产受到资源、产地的限制，难以规模化生产，人工合成的甜蛋白价格昂贵，限制了它的应用。因此，利用工程技术生产des-pGlu1-Brazzein具有重要意义。由于des-pGlu1-Brazzein发现较晚，对于其基因工程的研究还较少，主要是在原核生物大肠杆菌和乳酸球菌中表达[4-5]，我们也曾经优化了des-pGlul-Brazzein的编码序列，使其在大肠杆菌得到了高效表达[6-7]。但是存在的主要问题是得到的产物以包涵体的形式存在，纯化后的 des-pGlu1-Brazzein还需要进一步的复性才具有活性。为克服这些缺点，本研究按照酵母密码子的偏爱优化了des-pGlu1-Brazzein (Bra) 编码序列，采用目前广泛使用的毕氏酵母 Pichia pastoris作为宿主菌，构建了des-pGlu1-Brazzein高效分泌表达的酵母工程菌株。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和载体

4对编码des-pGlu1-Brazzein的寡聚核苷酸片段和2对引物均由上海生工生物工程有限公司合成。PUC18-T载体购自上海生物工程公司。……