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甲型H1N1流感病毒(2009)及其核酸诊断试剂的研发与临床应用

2011-02-09李琳戈军曹健荣

中国医药生物技术 2011年6期
关键词:流感病毒亚型探针

李琳,戈军,曹健荣

·生物诊断技术·

甲型H1N1流感病毒(2009)及其核酸诊断试剂的研发与临床应用

李琳,戈军,曹健荣

流感是一种至今尚无法完全控制的急性呼吸道传染病,可周期性地引起世界性大流行。自 20 世纪以来,有明确记载并有病原学依据的世界流感大流行一共有 4 次。其中发生于 1918 – 1919年[1-3]的西班牙大流感,由 H1N1 亚型流感病毒引起,这是目前所知最大的一次流感大流行,估计有2500 万 ~ 4000 万人死亡;发生于 1957 年的亚洲流感,由H2N2 亚型流感病毒引起,导致了数百万人的死亡,H2N2病毒是由当时流行的 H1N1 病毒与禽流感病毒 H2N2 病毒重配而来;1968 年的香港流感是由 H3N2 病毒[4]引起,该病毒由禽流感病毒和当时流行的人流感病毒重配;1977 年 H1N1 亚型流感病毒在 20 年后重新出现,这次流感规模远远小于前几次,其病毒就是 1957 年之前在人群中流行的 H1N1 病毒,但这种病毒如何在自然界存在,然后又重新爆发的机制尚不清楚,很难设想一种病毒在某种宿主中存在 20 年而没有发生任何变异。

自 2009 年 3 月,墨西哥和美国先后发现了甲型 H1N1流感病毒感染病例[5-6],随后全球确诊病例人数不断上升。截至北京时间 6 月 15 日 23∶00,WHO 共接到 76 个国家累计报告甲型 H1N1 流感确诊病例 35928 例,死亡163 人。截至 6 月 15 日 24 时,我国 18 个省份累计报告甲型 H1N1 流感确诊病例 232 例。目前的数据显示,甲型 H1N1 流感病毒已经具备了人际传播的能力,人群对该病毒的免疫低下,因此病毒在人际之间的传播能力较普通流感病毒更强。世界卫生组织已经将该次甲型 H1N1 流感疫情的预警程度上升到 6 级[7]。

秋冬季节是流感极易流行的时期,有可能引起甲型H1N1 流感病毒的严重爆发。因此,建立甲型 H1N1 流感病毒的快速检测方法,生产能广泛用于临床的、准确有效的实验室诊断试剂盒势在必行。

1 甲型 H1N1 流感病毒的分子生物学特征

流感病毒属于正黏病毒科[8],依据病毒表面的凝血素抗原(HA)共分 3 型,即甲(A)、乙(B)和丙(C)型流感病毒。甲型(A 型)流感病毒可以感染哺乳动物(人类、猪、雪貂、马)以及鸟类。甲型流感病毒形态多样,有球形、丝状或不规则状,中等大小,有囊膜。囊膜表面上突出的糖蛋白,通常称为“纤突”,是主要的表面抗原,由血凝素(H)和神经氨酸酶(N)两种组成,具有高变异特性。根据该两种蛋白抗原性的差异甲型流感病毒又分不同种亚型[9-10],迄今共发现 HA 亚型 16 种(H1 ~ H16),NA 亚型 9 种(N1 ~ N9)。甲型流感病毒是一种分节段 RNA 病毒,共含有 7 条结构蛋白基因和 1 条非结构蛋白基因(NS),结构蛋白分别为核蛋白(NP)、基质蛋白(M)、HA、NA、PA、PB1 和 PB2,其中前 4 种蛋白为病毒粒体的组成成分,后3 种蛋白均为功能性多聚酶,参与病毒基因的转录和复制,在病毒粒体中属于分子量最大但含量极少的蛋白。NS 蛋白存在于受病毒感染的细胞中,病毒粒体中检测不到,具体功能尚不清楚[11]。

根据美国疾病预防控制中心和 WTO 公布的流感病毒的基因组成信息,研究人员将甲型 H1N1 流感病毒的基因与已经掌握的部分猪流感病毒的基因进行了对比,利用流感病毒信息库和快速分析平台,对已报道的 22 株病毒序列进行分析,各分离株的核苷酸序列的同源性达到 99% 以上,属于同一株病毒[12]。对 HA 基因和 NA 基因进行分析,确认引起本次疫情的病原体属于 A/H1N1 亚型流感病毒[13]。同时对病毒全部 8 条基因进行进一步分析,发现此次流行的病毒株包含一种较为独特的基因片段组合,是来自北美和欧亚两种猪流感病毒的混合体。

本次流行的流感毒株的 HA 基因核苷酸序列与早期从美国分离到的 H1N2的猪流感病毒株的同源性达到 93%以上,其中与印第安纳州的 H1 亚型猪流感病毒[A/Swine/ Indiana/P12439/00(H1N2)]具有 95% 的同源性。提示本次 A/H1N1 流感病毒的 HA 基因由北中美洲本地的猪流感病毒变异而来。NA 基因没有发生核苷酸缺失,其序列具有欧亚株系猪流感病毒的特征。与之同源性在 90% 以上的病毒都来源于欧亚地区的 H1N1 猪流感病毒,其中A/ Swine/England/195852/92(H1N1)、A/swine/Spain/WVL6/ 1991(H1N1)的核苷酸同源性达到了 94%。M 基因的核苷酸序列也与欧亚株系的猪流感病毒的同源性最高,达到96%。提示 NA 和 M 基因来源于欧亚株系的猪流感病毒。

这种来自北中美和欧亚两种猪流感病毒的混合体是一种新型的 A/H1N1 病毒,以前从未发现在猪群中感染和流行,也从未在美国以及其他国家的猪流感和人流感病毒分离株中出现,GenBank 中也未有类似基因组合的病毒序列的报道。欧亚猪流感病毒通常仅在欧亚流行,还没有报道说在人体内被发现过,人体对这种病毒缺乏免疫保护作用,这可能是此病毒快速传播的原因之一。

2 流感病毒的实验室检测方法

卫生部印发的《甲型 H1N1 流感诊疗方案(2009 年试行版第一版)》中,介绍了甲型 H1N1 流感病例的诊断标准。出现流感样临床表现,同时有以下一种或几种实验室检测结果可判定为确诊病例:①甲型 H1N1 流感病毒核酸检测阳性;②分离到甲型 H1N1 流感病毒;③血清甲型 H1N1 流感病毒的特异性中和抗体水平呈 4 倍或 4 倍以上升高。目前常用的实验室检测方法有如下几种。

2.1 抗原检测

胶体金快速抗原检测技术是目前临床对流感病毒进行应用检测的最常用方法[14]。该技术具有结果直观、灵敏度高、快速等诸多优点,直接取鼻咽拭子作为抗原检测,20 min 可判断结果,适于现场使用。但是该技术只能鉴别甲乙型流感病毒,不能确定亚型,具有一定的局限性。

2.2 血清学检测

血清学检测主要包括红细胞凝集抑制试验和微量中和试验。红细胞凝集抑制试验的原理是利用血清中的抗体与病毒表面血凝素抗原的结合从而抑制病毒粒子与红细胞结合而导致红细胞不出现凝集的现象。微量中和试验的原理是通过血清中中和抗体与活病毒反应而阻止病毒感染细胞,直观地反映了细胞-病毒-抗体的相互作用。

血清学检测需要急性期和恢复期两份血清,急性期主要针对 IgM 进行抗体检测,但 IgM 在体内维持时间短,且目前尚无成熟的针对 IgM 的特异性检测方法。目前主要针对恢复期的 IgG 进行抗体检测,诊断存在滞后性,对流感的预防没有实际意义。因此血清学检测方法主要用于流行病学分析和回顾性诊断[15-17]。

2.3 核酸检测

2.3.1RT-PCR RT-PCR 是一种快速灵敏和特异的核酸RNA 检测方法。能准确检测到新甲型 H1N1 流感病毒多个特异性基因,区分出季节性 H1N1 流感病毒,适用于普通医务和检验检疫人员使用;多重 RT-PCR 检测试剂盒,能够多点、全面检测到新甲型 H1N1 流感病毒的多个特异基因,适用于流感监测机构和临床[18]。

2.3.2荧光 PCR 法 荧光 PCR 技术是利用荧光染料在光刺激下释放的荧光能量的变化来直接反映出 PCR 扩增产物量变化的核酸检测技术,具有高度的灵敏性、特异性和精确性。该技术根据荧光作用方式分为:SYBR 荧光染料法、TaqMan 技术、分子信标和复合探针等类型,依据其各自优缺点可将各技术方法分别应用于不同方面的科研工作中,以期得到最优的检测效率。它以特异性强、灵敏度高、重复性好、速度快、全封闭反应等优点成为了分子生物学研究中的重要工具。

3 甲型 H1N1 流感病毒 RNA 检测试剂盒(荧光PCR 法)的研究

3.1 技术原理

荧光 PCR 法是指在 PCR 反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个 PCR 进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定性分析的方法。

本产品所使用的荧光基团为 TaqMan 荧光探针。TaqMan 荧光探针的工作原理为:PCR 扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR 扩增时,Taq 聚合酶的 5′ – 3′ 外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条 DNA 链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步。

从 GenBank 数据库和中国国家流感中心病毒序列数据库中下载猪源流感病毒 H1N1 和甲型流感病毒 H1N1、H3N2、H5N1 等亚型 M 基因、NP 基因和 HA 基因全序列,软件比对分析所有甲型流感病毒 M 基因序列的一致性,选择相对保守区设计引物和探针;将猪源 H1N1、新甲型 H1N1 和季节性甲型流感病毒 H1N1 所有 NP 基因和HA 基因序列放在一起比对,选择相对保守区设计引物和探针。同时选择人 RNaseP 基因作为内参,实时监控整个样本处理及 PCR 扩增过程。

3.2 产品的创新点

本产品采用荧光 PCR 法,具有灵敏度高、特异性好等优点,可使甲型 H1N1流感病毒在早期检出。同时该法可重复性好,受人为影响小。本试剂盒中包含 4 对扩增引物(FluA、SWH1、SWFluA1 和内参 RNP)及探针,提高了检测的特异性,可有效区分季节性流感和猪流感患者。本产品采用人工 RNA 假病毒作为阳性对照品,增强了阳性对照的稳定性。

3.3 临床意义

甲型 H1N1 流感病毒可经呼吸道传染,传播途径与季节性流感类似,主要传染源来自感染病毒的猪或人及隐性感染者,被甲型 H1N1 流感病毒污染的物品和环境也是潜在的感染来源。甲型 H1N1 流感病毒与流感、禽流感、上呼吸道感染、肺炎、SARS、传染性单核细胞增多症、巨细胞病毒感染、军团菌肺炎、衣原体、支原体肺炎等在症状上很难鉴别。

采用甲型 H1N1 流感病毒 RNA 检测试剂盒可对呼吸道等样本中甲型 H1N1 流感病毒 RNA 进行定性检测,可用于该病毒感染的实验室辅助诊断和监控,辅助判定流感样症状病例是否感染甲型 H1N1 流感病毒。检测结果仅供临床参考,不能单独作为确诊或排除病例的依据。该产品技术方法处于国内领先水平,将改变我国目前甲型 H1N1 流感病毒检测的严峻局面,能够快速、准确地对甲型H1N1流感病毒进行检测,具有极高的实用性和推广价值。

4 小结

综上所述,甲型 H1N1 流感毒株,是一种包含有猪流感、禽流感和人流感3 种流感病毒基因片段的新型流感病毒,该病毒在人际之间的传播能力较普通流感病毒强。目前,关于甲型 H1N1 流感病毒的检测试剂盒,国内外均无有批准文号的同类商品报道。由于荧光 PCR 方法具有较高的检测灵敏度和特异性,使得甲型 H1N1 流感在早期即可检出,有利于甲型 H1N1 流感预防控制工作。

由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所研制,北京金豪制药股份有限公司负责产品产业化的甲型 H1N1 流感病毒 RNA 检测试剂盒采用荧光 PCR 方法,保证了试验结果的可重复性和减少人为操作影响。本试剂盒的成功开发与产业化为甲型 H1N1 流感诊断提供了便利。

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10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2011.06.008

100176 北京金豪制药股份有限公司研发部

李琳,Email:lli@kinghawk828.com

2011-11-03

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