李丹丹 李岩

土槿皮乙酸对肝癌 BEL-7402细胞转移能力的影响

李丹丹 李岩

目的 研究土槿皮乙酸对人肝癌 BEL-7402细胞株转移能力的影响。方法 体外培养人肝癌 BEL-7402细胞株,用不同浓度 PAB及只用培养基(对照组)作用不同时间后,应用 MTT法筛选最佳药物浓度。通过 Transwell检测 PAB对细胞迁移能力的影响。结果 土槿皮乙酸作用后肝癌细胞粘附率较对照组明显下降(P＜0.05),并呈时间和浓度依赖性。土槿皮乙酸作用后迁移细胞数明显低于对照组。结论 土槿皮乙酸能抑制肝癌细胞增殖,降低肝癌细胞转移能力。

土槿皮乙酸;肝癌细胞;增殖;转移

土槿皮乙酸(pseudorlaricacid-B,PAB)是从我国的松科植物金钱松的根皮及近根皮中分离出来的二萜类化合物,为一种单体成分。研究证明 PAB可以抑制胃癌[1,2]、肝癌[3]、宫颈癌[4]白血病[5]等多种肿瘤细胞的增殖并诱导细胞凋亡,但尚未发现有关 PAB对肝癌侵袭转移作用的报道,本实验将探讨 PAB对肝癌细胞转移能力的影响,以为进一步开发治疗肝癌的新药提供试验依据。

1 资料与方法

1.1 细胞株与细胞培养 人肝癌细胞株BEL-7402由中国医科大学附属盛京医院传染科实验室惠赠,在含 10%胎牛血清的 RPMI1640培养液、饱和湿度,饱和温度为 37℃,CO2浓度为 5%的培养箱中培养。

1.2 材料 RPMI1640培养基购自 Gibco公司、胎牛血清购自天津灏洋生物制品公司;噻唑蓝(MTT)购自 Sigma公司;带有 8μm微孔聚碳酸酯膜的 Transwell细胞培养小室购于美国 Costar公司。土槿皮乙酸标准品购自中国药品生物制品检定所,批号:110880。

1.3 MTT比色法检测细胞增殖 收集对数生长期的 BEL-7402细胞,接种于用 96孔培养板中,每孔 100μl。实验组一组加 0.5μmol/L-1PAB分别培养 24、48、72h,另一组加入不同浓度的 PAB使其终浓度分别为 4、2、1、0.5μmol/L,培养 24 h。对照组加入 100μl含 10%胎牛血清的培养基,于上述培养时间后,加入浓度为 5g/L的 MTT20μl。继续培养 4h后加 DMSO150μl,振荡 10min后,用酶联仪于 570nm处测出各孔吸光度值(OD),计算生长抑制率,实验重复 3次。生长抑制率 =[1-(处理组平均 OD值/对照组平均 OD值)]×100%。

1.4 Transwell检测 PAB对 BEL-7402细胞转移能力的影响取指数生长期的细胞用于实验,打匀的细胞悬液加入 Transwell小室,同时加入 0.5μmol/L-1PAB,我选择的 PAB浓度是用 MTT筛选出的 72h的 IC50,以血清浓度差作为趋化条件:小室内为含 1%血清的培养基,下室为含 30%血清的培养基。常规培养 24h后予甲醇固定,姬姆萨染色,取膜,封片,镜检。

1.5 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件,计量资料以均数(±s)表示,采用 t检验,P＜0.05具有统计学意义。

2 结果

2.1 PAB对 BEL-7402细胞增殖的影响 不同浓度 PAB(0.5,1.0,2.0,4.0)作用相同时间,随着药物浓度的增加,对细胞生长的抑制率增加,相同浓度 PAB作用不同时间(24,48,48h),随着时间的增加,对细胞生长的抑制率增加。表现出明显的剂量依赖性和时间依赖性 0.5μmol/LPAB作用 24 h,对细胞生长无显著影响。(表 1)

表 1 MTT法检测 PAB对 Bel-7402细胞增殖的影响

2.2 PAB对 BEL-7402细胞转移能力的影响 0.5μmol/LPAB组作用 24h后迁移细胞数明显低于对照组,对照组细胞轮廓清晰,活力旺盛,PAB组细胞明显变圆,稀疏。提示PAB对于肝癌BEL-7402细胞的迁移能力有明显的抑制作用(见图 1)。

图 1 Transwell检测 PAB对 BEL-7402细胞迁移的影响

3 讨论

土槿乙酸传统上是作为一种抗真菌药物,后来发现其具有抗生育、抗血管生成和抗肿瘤作用。研究证明 PAB可以抑制胃癌[1,2]、肺癌、肝癌[3]、宫颈癌[4]白血病[5]等多种肿瘤细胞的增殖并诱导细胞凋亡,但尚未发现有关PAB对肝癌侵袭转移作用的报道,本实验研究发现土槿皮乙酸作用后肝癌细胞粘附率、转移细胞数较对照组明显下降(P＜0.05),并呈时间和浓度依赖性。土槿皮乙酸对肝癌细胞增殖和凋亡的影响,其作用机制可能与清除氧自由基,作用于细胞周期集细胞周期蛋白依赖性激酶,影响 p53、Bcl-2家族、Caspase激活[6],影响与肿瘤发生密切相关的细胞信号传导通路等有关。

PAB具有明确的抑制血管生成作用,血管内皮生长因子(VEGF)是最具有效性和特异性的诱导血管内皮生成的因子[7],是多种抗肿瘤药物的作用靶点。2004年 TanWF等的研究显示 PAB可以阻止 VEGF诱导的KDR磷酸化,但是并不影响 KDR的总蛋白水平。另外 PAB也降低了 Akt和ERK的磷酸化[8]。土槿皮乙酸有效剂量内并未观察到毒性反应,通过用BALB/C-nu祼鼠进行活体肝肿瘤药敏试验显示:PAB对肿廇的抑制呈剂量依赖性,25mg/(kg·d)的剂量可以被动物耐受,且没有毒性表现和体质量减轻现象[9]。

综上所述,土槿皮乙酸对肝癌细胞增殖和凋亡[3]确实有影响,本实验发现土槿皮乙酸对肝癌转移能力有抑制作用,但其作用机制还有待进一步研究,以为进一步开发治疗肝癌的新药提供试验依据。

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[2] Meng AG,Jiang LL.JAsian Nat Prod Res.Pseudolaric acid B-induced apoptosis through p53-dependent pathway in human gastric carcinoma cells,2009,11(2):142-152.

[3] 鞠晓华,徐永红,李岩.土槿皮乙酸对 BEL-7402细胞凋亡、线粒体膜电位及 COX-2蛋白表达的影响.世界华人消化杂志,2008,4,16(11):1151-1156.

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[6] 龚显峰,王敏伟,田代真一.土槿皮乙酸体外诱导 A 375-S2细胞凋亡.中国中药杂志,2005,30(1):55-57.

[7] eung DW,CachianesG,KuangWJ,etal.Vascularendothelia growth factor is a secreted angiogenicmitogen.Science,1989,246(4935):1306-1309.

[8] 宋永锋,陈 虹,李灵芝.土槿皮的研究进展.天津药,2001,13(6):2549-103.

[9] wong VK,chiu P,chung SS,Chow LM,Zhao YZ,Yang BB,Ko BC、Pseudolaric acid B,a novelmicrotubule-destabilizing agent that circu Mventsmultidrug resistence phenotype and exhibits antitumoractivity in vivo.Clin Cancer Res,2005,11:6002-6011.

110004中国医科大学附属盛京医院