张 玲 王庆才

(1．泰山医学院附属泰山医院肿瘤内科，山东 泰安 271000； 2．泰山医学院附属泰山医院消化内科，山东 泰安 271000)

胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,近年来发病呈上升趋势,肿瘤的治疗,除传统的手术、化疗和放疗等手段外,利用生物制剂或进行基因治疗正在成为一种新的治疗策略。细胞凋亡[1-2]是一种程序性细胞死亡,是机体胚胎发育和组织更新过程中清除衰老及异常细胞的主要途径。该过程受凋亡促进因子和凋亡抑制因子的共同调节，因此,系统的研究生物制剂对肿瘤细胞的凋亡诱导作用及对凋亡相关基因的影响,对肿瘤的治疗具有重要意义。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)[3-4]是TNF家族中诱导凋亡的分子之一,TRAIL通过与其特异性膜受体结合而诱导凋亡。本研究进一步探讨TRAIL对胃癌细胞株MKN28细胞体外诱导凋亡的影响，为胃癌的治疗提供新的途径。

1 材料与方法

1.1细胞培养 人胃癌细胞株MKN28细胞购于第四军医大学实验动物中心，培养于含10%新生牛血清的RPMI Medium 1640(Gibco, USA)培养基中,在5%C02,37℃饱和湿度培养箱内孵育，一般3～4天用0.25%胰酶消化传代一次。

1.2试剂 TRAIL(美国Peprotech公司)；Caspase-3(中杉金桥)；Annexin V细胞凋亡检测试剂盒(广州长瑞生物技术有限公司)；兔SP检测试剂盒(中杉金桥)；MTT( Sigma公司)。

1.3药液的制备及分组 将人可溶性TRAIL稀释到所需浓度,TRAIL终浓度分别为50 ng/ml，100 ng/ml，200 ng/ml，400 ng/ml，800 ng/ml，同时设置对照组。

1.4MTT实验 取处于指数生长期的人胃癌细胞株MKN28细胞经胰酶消化,配成悬液,用96孔细胞板,培养细胞。待细胞贴壁后，将药液分别加入各孔,每个剂量重复4孔。然后孵育8 h,12 h,24 h,48 h,72 h后加入1 mg/ml的 MTT溶液，孵育1 h,使MTT还原为Formazan，吸出上清液,加入100 μl DMSO使Formazan溶解,混悬仪混匀后用酶标仪在490 nm处测定OD值，计算抑制率(%)=(1-实验组OD/对照组OD)×100%，形态学观察用不同浓度的TRAIL处理人胃癌细胞株MKN28在倒置显微镜下形态变化,并摄影。

1.5流式细胞仪检测细胞凋亡 将各浓度的TRAIL分别加入培养细胞至预定时间后,用0.25%胰蛋白酶消化，弃去消化液,加入PBS液;吸管吹打细胞，取约1×106个待测细胞,制备细胞悬液，加入10 μl Annexin V-FITC和5～10 μl 碘化丙啶,混合均匀，孵育15 min;加入400 μl 1倍结合缓冲液,细胞上机检测，利用流式细胞仪488 nm波长分析凋亡细胞，并设定PBS对照组。

1.6流式细胞仪分析细胞DNA含量 TRAIL蛋白处理过的MKN28细胞及对照组至预定时间后,经PBS洗涤、离心后配成1×106/ml细胞悬液，过滤后单细胞悬液用75%冰乙醇固定于-20℃冰箱;去乙醇、离心、PBS清洗，制成细胞悬液;加入PI染液0.5 ml， 4℃避光染色30 min以上后过滤，上机检测,用流式细胞仪测定细胞DNA结合PI的荧光强度,分析DNA含量和细胞周期。

1.7细胞免疫组化检测Caspase-3的表达 将处于生长对数期的细胞按1×105个/孔接种于铺有载玻片的6孔板, 细胞生长80%～90%融合时, 分组并将不同浓度的TRAIL分别加入培养细胞，继续培养至预定时间后取出盖玻片, 荧光显微镜下观察拍照后用4%的多聚甲醛固定、清洗， 加3%H2O2后清洗，滴加抗体、清洗、脱水，透明，封片，镜检。

1.8AO/EB双染色 分别收集经TRAIL蛋白处理至预定时间的MKN28细胞及对照组细胞, 制备单细胞悬液，调细胞密度后加入AO和EB混合液, 滴于载玻片, 盖片封片后荧光显微镜直接观察,荧光显微镜510 nm激发波长观察。

2 结 果

2.1倒置显微镜观察治疗前后各组细胞形态学变化 治疗前，在倒置显微镜下观察发现，胃癌MKN28细胞呈贴壁生长，生长旺盛，治疗后12 h、24 h、48 h、72 h观察各组细胞有不同程度的变化，细胞部分变圆浮起，细胞间接触变松，间距增宽，增殖变慢，细胞中颗粒增多，细胞周围出现碎片。而且随着TRAIL蛋白浓度的升高，这种变化越发明显，出现大量碎片(图1)。对照组变化不明显(图2)。

图1 200ng/ml TRAIL作用后的MKN28细胞

图2 对照组

2.2AO/EB双染色结果 AO/EB染色及荧光显微镜观察，不同浓度的TRAIL作用MKN28细胞后，出现典型的凋亡形态学改变,并随浓度和时间的增加而越发明显，早期凋亡细胞表现为细胞体积缩小，胞核呈黄绿色，致密固缩浓染或碎片状，胞膜尚完整，胞质桔红色；而晚期凋亡细胞表现为染色质被EB染成橙色，呈固缩状或圆珠状；坏死细胞核染色质也被EB染成橙色或红色，但细胞核染色质结构尚正常(图3)。空白对照组未经TRAIL处理的正常活细胞核呈圆形，核染色质被AO染成均匀一致的绿色或黄绿色，核染色质呈正常结构(图4)。

图3 200ng/mlTRAIL作用后MKN28细胞

图4 对照组

2.3MTT细胞增殖活性结果 TRAIL蛋白作用于胃癌MKN28细胞，随着TRAIL浓度的增加，对细胞的抑制率增高，具有剂量依赖性； TRAIL蛋白治疗组与空白对照组相比较具有统计学意义(P<0.05，表1)。

2.4流式细胞仪检测细胞凋亡率结果 流式细胞仪检测经不同浓度TRAIL(50 ng/ml，100 ng/ml，200 ng/ml，400 ng/ml，800 ng/ml)处理MKN28细胞，MKN28细胞的凋亡率随着浓度的增高而升高(图5)，各实验组与对照组相比有统计学意义(P<0.05)。

2.5流式细胞仪检测DNA含量及细胞周期结果 MKN28细胞经TRAIL作用后，细胞被阻滞于G0/G1，S期和G2/M期细胞数明显减少，细胞分裂受到抑制，凋亡率增加，DNA含量图可见在DNA细胞周期峰前有一个亚二倍体峰，经凋亡程序软件分析，确认为凋亡峰(图6)。

图5 50ng/ml TRAIL作用于MKN28细胞凋亡率(Annexin V)

图6 50ng/ml TRAIL作用于MKN28细胞凋亡率(DNA含量)

2.6Caspase-3的表达结果 Caspase-3免疫染色阳性结果为细胞浆内棕黄着色(图7～8)。

图7 100ng/mlTRAIL作用后MKN28细胞caspase-3的表达

图8 200ng/mlTRAIL作用后MKN28细胞caspase-3的表达

表1 不同浓度、时间TRAIL蛋白作用胃癌MKN28细胞的抑制率

3 讨 论

目前研究认为，肿瘤的发生与基因密切相关，基因突变或基因表达失常是肿瘤发生的关键。这些变化包括：原癌基因的激活、肿瘤抑制基因的失活、凋亡调节基因及DNA修复基因的突变等。其中凋亡调节基因表达异常使细胞凋亡过程失去控制，在肿瘤形成过程中起着十分重要的作用。因此对凋亡相关基因及其表达产物与肿瘤关系的深入研究，在揭示肿瘤的发病机制、早期诊断、预防及治疗肿瘤方面均具有重要意义。以细胞凋亡为研究手段，进一步探讨肿瘤的发生机制，开发新的肿瘤治疗药物及治疗方法是控制肿瘤的最好途径[5]。

本实验结合MTT和流式细胞仪结果，观察研究TRAIL体外对胃癌MKN28细胞增殖抑制率及诱导凋亡的影响。实验结果表明，不同浓度的TRAIL均能抑制胃癌MKN28细胞的增殖活性，对细胞生长的抑制呈时间和剂量依赖性。可以判断TRAIL在体外对胃癌MKN28细胞具有杀伤作用，可抑制肿瘤细胞的增殖，其原理可能是启动了Caspase介导的凋亡通道。目前研究认为，许多抗癌因素充当了凋亡的诱导因子，耐药的形成主要与药物触发凋亡的能力下降有关，尽管不同的抗癌药物有不同的细胞内靶点，但诱导细胞毒性最终集中到一种共同通道，即诱导凋亡。而且药物引起的细胞凋亡频繁地由Caspase级联介导，尽管许多抗癌药物介导细胞凋亡最终依赖激活Caspase级联信号[6-7]，但确切的分子机制尚不清楚。本研究也证实TRAIL诱导信号为凋亡诱导。其作用是放大了药物的凋亡活性，这种效应上调了关键酶Caspase-3的表达，延长了Caspase-3的半衰期并增强了其生物学活性，促进DR4[8-9]、DR5[8]的敏感功能，反馈性的加强了TRAIL诱导凋亡的活性，提高了TRAIL对肿瘤细胞的敏感性。初步实验证实， TRAIL 蛋白能够抑制体外培养的人胃癌MKN28细胞的生长、增殖，并诱导细胞凋亡； 对 TRAIL 介导的细胞凋亡率上升。根据国内外的相关实验研究，结合本次的实验结果，我们推测，TRAIL可能通过上调Caspase-3的表达进而影响人胃癌MKN28细胞的凋亡过程。而Caspase-3活性反馈性的加强了TRAIL诱导细胞凋亡的敏感性。这对临床减少抗癌药物的用量，减少耐药具有重要的应用价值。

总之，本实验对调亡相关基因的研究为胃癌的诊断及治疗提供了新的思路。随着对细胞凋亡基础研究的进一步深入，将为胃癌治疗提供科学依据，并且为发掘新的抗癌药物拓宽研究领域。但是，尚有许多问题需进一步阐明，如多种组织细胞能自身分泌可溶性 TRAIL，实验时应同时检测其表达水平并进一步探讨DR4、DR5、Caspase-3蛋白水平的表达与mRNA表达的作用机制。以上问题如能进一步研究阐明，必将为肿瘤及其它与凋亡调控异常相关疾病的病因全面揭示提供重要线索。

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