盛跃颖 ,陈 敏 ,陈洪友 ,姜 华 ,张 曦 ,吴 凡

肠出血性大肠埃希菌(EnterohemorrhagicEscherichia coli,EHEC)O157∶H7是一种能引起出血性结肠炎,溶血性尿毒综合征(Hemolytic uremic syndrome,HUS)等严重并发症的新型病原菌。我国自1986年首次报告 EHEC O157∶H7感染病例以来。国内多个省市和地区陆续在腹泻病患者、家畜家禽的粪便和食品中检测出了 EHEC O157∶H7[1-2]。本实验主要是通过聚合酶链反应(PCR)和脉冲场凝胶电泳技术对上海地区从腹泻病人、牛粪及食品中分离的玻片凝集初筛为E.coliO157的菌株进行进一步分子特征研究,了解不同来源的各菌株之间的关系,为流行病学研究提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 菌株与细胞 4株 EHEC O157∶H7标准菌种:编号 G1329,G2534,来源于德国,由南开大学泰达生物技术学院提供;编号J4-92,J75-96,由日本京都大学竹田多惠博士惠赠。9株E.coliO157∶H7分离株:编号4,17于2006年分离自上海地区的腹泻病人;编号780,782,783,784,798,799于2008年分离自上海某区县同一监测点的牛粪;编号378为2009年分离自食品。2006-2009年分离的4株E.coliO157菌株:编号7,8,440,441,分离自牛粪。大肠埃希菌A TCC 25922作为阴性对照。沙门菌H9812作为PFGE实验的分子量标准对照。Vero细胞株为本实验室保存。

1.2 主要试剂与仪器 菌株的生化鉴定采用法国BioMerieux公司的API 20E微量生化试剂条,血清学分型采用泰国S&A公司的大肠埃希菌O157诊断血清。PCR反应液(Premix Taq○RVersion2.0),DL 1000 DNA marker,XbaⅠ内切酶购自大连宝生物有限公司;蛋白酶 K为 Promega公司产品;SeaKem Gold Agarose购自美国 Cambrex Bio Rockland公司;十二烷基肌氨酸钠购自 Sigma公司。试剂均在有效期内使用。PCR扩增仪,脉冲场凝胶电泳仪(Chef-Mapper),凝胶成像仪(GEL Doc2000)均为美国Bio-Rad公司产品。

1.3 菌体抗原基因、鞭毛抗原基因及主要毒力基因的聚合酶链反应。

1.3.1 引物 检测菌体抗原基因rfb O157,鞭毛抗原基因flic H7,志贺毒素 stx1、stx2,溶血素基因Hly,粘附抹平因子基因eaeA的引物序列见表1。……