陶永清，刘崇基，李健娇，徐新，王津晗，韩娜，张磊，赵辉，阮海华，王昌禄

沙门菌是严重威胁人类健康的主要食源性致病菌之一。据统计，在世界各国的细菌性食物中毒中，沙门菌引起的食物中毒常列榜首[1]，我国内陆地区也以沙门菌导致的食物中毒为首位[2]。

SopB 是沙门菌主要致病性蛋白成分，是由沙门菌 SPI-1 III 型分泌系统分泌的一种由 561 个氨基酸构成的蛋白质分子，具有肌醇磷脂酶（phosphoinositide phosphatase）活性[3]。SopB 在沙门菌感染过程中发挥着不同的重要功能[4-8]。细胞蛋白激酶 MAPK，包括 Erk1/2（extracellular signalregulated kinases 1 and 2）、p38（P38 mitogenactivated protein kinases）和 JNK（c-Jun N-terminal kinases），其对沙门菌感染均具有重要的调节作用，因此，研究 SopB 对细胞蛋白激酶 MAPK 信号的影响非常必要。本文采用基因克隆的方法将沙门菌SopB 基因克隆至质粒载体上，检测 SopB 在细胞中的过量表达对细胞蛋白激酶 MAPK 磷酸化水平的调节作用，为 SopB 的功能研究提供更多的信息。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株、宿主菌和质粒载体 鼠伤寒沙门菌 Salmonella Typhimurium LT2、大肠杆菌E. coli Trans 10 宿主菌由本实验室保存；表达用质粒 pCS2-EGFP 由本实验改造，该质粒由 pCS2 改造而来，将绿色荧光蛋白（GFP）的基因克隆至质粒表达框的 N 端，并在 pCS2 质粒的多克隆位点（MCS）上加入 FseI 和 AscI 两个酶切位点。

1.1.2 酶和试剂 质粒 DNA 提取试剂盒和胶回收试剂盒为英国 Omega 公司产品；Vent DNA polymeras 和限制性内切酶 FseI 和 AscI 购自美国 NEB 公司；细菌基因组提取试剂盒购自北京天根公司；T4 DNA 连接酶购自美国 Promega 公司；PVDF 膜购自德国 Milipore 公司；兔抗、Tubulin单抗购自美国 Cell Signaling 公司；其他试剂为国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 根据 GenBank 上已登录的鼠伤寒沙门菌 Salmonella Typhimurium LT2基因组的全序列（NC_003197）查找到 SopB 基因序列（NP_460064.1）。利用 Primer 5.0 软件设计引物，以扩增 SopB 基因的全序列。根据 SopB 基因全序列设计相应的引物，以扩增 SopB 基因的Δ29、Δ46 以及 Δ112 的各种基因片段。引物由上海生工生物技术有限公司合成，引物序列见表 1。1.2.2 重组质粒 pCS2-EGFP-SopB 以及各种truncation 的构建 将沙门菌 LT2 接种于普通LB 液体培养基中，37 ℃ 培养 18 h。取 1 ml 菌液提取基因组 DNA，具体操作参照试剂盒推荐的方法，提取的基因组 DNA 经 0.8% 琼脂糖凝胶电泳检测，–20 ℃ 保存备用。

表 1 SopB 以及各种 SopB 基因片段的扩增与载体构建所用的引物Table 1 Primers for cloning of SopB and its several derives of truncations

以该基因组 DNA 作为模板，利用 P1-FseI 和P2-AscI 引物进行 PCR 扩增。反应条件为：94 ℃6 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30 个循环；72 ℃ 10 min。琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物。回收纯化 PCR 产物，用限制性内切酶 FseI 和AscI 进行双酶切并纯化。同时将质粒 pCS2-EGFP也经同样双酶切和纯化。其中，pCS2-EGFP 是本实验室改造的载体，该载体能够在细胞中高效表达N 端带有绿色荧光蛋白（GFP）的融合蛋白。把pCS2-EGFP 与目的片段的酶切纯化产物用 T4 连接酶体系连接，转化 Trans 10 大肠杆菌感受态细胞，涂布于含 Ampr的 LB 平板上，37 ℃ 培养12 ～ 16 h。挑取单个菌落接种于含 Ampr的 LB 液体培养基中，37 ℃、200 r/min 振荡过夜，酶切鉴定，测序确认插入正确。

对 SopB 各种 truncation 的构建分别采用 P3与 P2、P4 与 P2、P5 与 P2 引物对进行 PCR 扩增并将其 PCR 产物酶切，连接至 pCS2-EGFP 质粒上构建重组质粒，测序确认插入正确。

1.2.3 定点突变体的构建 SopB C460S 突变体的构建采用的是 Site-directed Mutagenesis Kit 的方法，如表 1 所示，设计一对互补的引物 P460F和 P460R，其中的 SopB 第 460 位 Cys 被突变为 Ser。PCR 反应条件为 94 ℃ 6 min；94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 10 min，16 个循环；72 ℃ 15 min。取 20 μl PCR 产物利用 DpnI 酶切 1 h，将酶切后产物转化到大肠杆菌 Trans 10 感受态细胞，37 ℃培养 12 ～ 16 h。挑取单个菌落接种于含 Ampr的LB 液体培养基中，37 ℃、200 r/min 振荡过夜，测序确认基因突变。

1.2.4 利用磷酸钙法将重组质粒 pCS2-EGFPSopB 转染 HeLa 细胞 重组质粒转染 HeLa 细胞采用的是 VigoFect（威格拉斯）试剂，取 5 μg DNA，加入稀释液中至总体积为 100 μl，轻轻混匀，室温放置。取 VigoFect 2 μl 加入稀释液中至总体积为 100 μl，轻轻混匀，室温放置 5 min。将稀释的 VigoFect 逐滴加入稀释的 DNA 溶液中，轻轻混匀，所得的转染工作液在室温放置 15 min。将转染工作液轻轻混匀，逐滴加入 2 ml 培养液中，轻轻混匀培养液，置 37 ℃，5% CO2培养 24 h 后收集细胞。

1.2.5 Western blot 蛋白表达的检测采用 western blot 的方法。将收集的细胞进行 SDS-PAGE 电泳，转膜，利用相应的一抗和二抗进行杂交，洗膜，通过辣根过氧化物酶作为底物进行化学发光，X 光片压片，洗片。

2 结果

2.1 SopB 基因表达检测

图 1 融合蛋白 GFP-SopB 及其 truncation 在 HeLa 细胞中的表达分析Figure 1 Expression of the recombinant protein GFP-SopB and its truncation derivates in HeLa cells

由于 SopB 的重组质粒表达的是 GFP-SopB融合蛋白，因此，首先利用 GFP 蛋白作为标签检测了 SopB 及其各种 truncation 在 HeLa 细胞中的表达情况，结果如图 1 所示，SopB 全长蛋白及其各种 truncation 均表达，而且其表达量随着SopB 蛋白的截短而逐渐提高，这可能与 SopB 转染引起的细胞死亡有关，当 SopB 蛋白的 N 端的112个氨基酸被去掉后，SopB 不再引起细胞死亡，SopB Δ112 的表达量会显著增加（结果未列）。2009年，Cell 杂志发表了SopB蛋白在沙门菌感染宿主细胞的过程中发生泛素化修饰的结果，这是 SopB的重要特征[7]。本研究结果也发现，当 SopB 蛋白在 HeLa 细胞中过量表达时有部分蛋白能够明显发生泛素化修饰，当 SopB 的 N 端 29 以及 46 个氨基酸分别被截取后不影响 SopB的泛素化，当其N 端 112 个氨基酸被截取后，SopB 不再发生泛素化修饰，这与 Cell 杂志报道结果相一致，即 SopB发生泛素化修饰的位点为其 N 端 112 个氨基酸区域内的赖氨酸。与细菌感染实验不同，将 SopB蛋白在 HeLa 细胞中过量表达仅检测到 SopB 的单泛素化修饰，而未能检测到在沙门菌感染实验中的 SopB 的多泛素化修饰，这可能由于感染过程中有多种因子，包括 LPS、Effector、CpG，DNA 等的参与有关，所以在沙门菌感染过程中可能存在其他的因素促进 SopB 的多泛素化修饰。

2.2 SopB 的过量表达激活 HeLa 细胞 MAPK 蛋白激酶的磷酸化

由于在沙门菌感染上皮细胞的过程中，LPS、效应分子中的 SopE/SopE2 以及 SpvC 均被发现对上皮细胞蛋白激酶 MAPK，包括 Erk1/2，p38 和JNK 具有调节作用。为研究 SopB 对上皮细胞蛋白激酶 MAPK 的调节作用，将 SopB 在细胞中进行表达并检测细胞蛋白激酶 MAPK 的磷酸化水平。如图 2 所示，SopB 转染与否对 HeLa 细胞蛋白激酶 Erk1/2、p38 和 JNK 的水平影响不大。但与转染空载体的对照相比，SopB 的表达显著激活了 pErk1/2、p-p38 以及 pJNK 的磷酸化水平，而当 SopB 肌醇磷脂酶活性关键氨基酸 C460 的突变则不能够诱导 pErk1/2、p-p38 以及 pJNK 的磷酸化。表明，SopB 对 HeLa 细胞蛋白激酶pErk1/2、p-p38 以及 pJNK 的磷酸化的激活与其肌醇磷脂酶活性直接相关。

图 2 SopB 激活 HeLa 细胞 pErk、p-p38 以及 pJNK 的表达Figure 2 SopB activates the level of pErk、p-p38 and pJNK in HeLa cells

2.3 SopB N 端 29 个氨基酸与 HeLa 细胞蛋白激酶 MAPK 的磷酸化激活有关

为进一步研究 SopB 上与诱导 HeLa 细胞MAPK 蛋白激酶 Erk1/2，p38 和 JNK 激活有关的结构域，我们通过 PCR 的方法构建了 SopB N端分别缺失 29 个、46 个以及 112 个氨基酸的truncation，并将各种 truncation 转染 HeLa 细胞。结果如图 3 所示，当 SopB 的 N 端缺失掉 29 个氨基酸后，SopB 不再激活 HeLa 细胞蛋白激酶MAPK 的磷酸化，表明 SopB N 端 29 个氨基酸与 Erk1/2，p38 和 JNK 的磷酸化激活有关，但是到目前为止，SopB 通过何种机制激活 HeLa 细胞蛋白激酶以及其 N 端 29 个氨基酸在此机制中通过何种方式起作用仍有待于进一步研究。

图 3 SopB 及其相应 truncation 激活 HeLa 细胞 pErk、p-p38 以及 pJNK 的情况Figure 3 The phosphorylation of pErk、p-p38 and pJNK in HeLa cells induced by SopB and its derivates

3 讨论

SopB 是由沙门菌 SPI-1 III 型分泌系统分泌的一种由 561 个氨基酸构成的蛋白质分子, 是一种肌醇磷脂酶。目前的研究发现，不同类型的沙门菌基因组间存在不同差异，其致病机制也有差异。但在引起人类疾病的五大类沙门菌中，除鸭沙门菌基因组未测序以外，SopB 广泛存在于其他几种能够对人类存在侵染性的不同类型的沙门菌中，足见其功能的重要性[6]。

目前已有的研究结果表明，SopB 的 N 端在SopB 诱导的信号转导途径中可能发挥重要的作用，其 N 端是 SopB 发生泛素化修饰的重要位点，SopB 的泛素化与其在细胞内的定位和功能直接相关[7]。因此，为了进一步研究与 SopB 诱导HeLa 细胞 MAPK 蛋白激酶 Erk1/2，p38 和 JNK激活有关的结构域，通过 PCR 的方法构建了SopB N 端分别缺失 29 个、46 个以及 112 个氨基酸的 truncation，并将各种 truncation 转染 HeLa细胞。结果如前所示，当 SopB 的 N 端缺失掉 29个氨基酸后，SopB 不再激活 HeLa 细胞蛋白激酶MAPK 的磷酸化，表明 SopB N 端 29 个氨基酸与 Erk1/2，p38 和 JNK 的磷酸化激活有关，但是到目前为止，SopB 通过何种机制激活 HeLa 细胞蛋白激酶以及其 N 端 29 个氨基酸在此机制中通过何种方式起作用仍不清楚。目前的研究表明，SopE、SopE2 和 SopB 通过不同的机制刺激 Rho-家族 GTP 酶信号，其中 SopE 和 SopE2 是Rac1、Cdc42 和 RhoG 交互作用因子，而 SopB 则是通过其磷脂酰肌醇磷酸酶活性刺激 RhoG 的交互作用蛋白 SGEF 来激活 RhoG[8]，但是目前SopB 通过何种机制激活 Cdc42 尚不清楚。而Cdc42 对于细菌进入细胞虽然可有可无，但是它能够有效地激活 MAPKs 信号。那么，SopB 激活宿主细胞的 MAPKs 是否与 Cdc42 的激活有关将是我们今后研究的一个靶点。

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