徐亦君， 竺明晨

结直肠癌是消化道常见的恶性肿瘤，其发病率在我国恶性肿瘤中位居第五，严重危害人类健康。组织相容性白细胞抗原G(HLA-G)为非经典的HLA I类分子，是一种重要的免疫耐受分子，能抑制NK细胞和CTL细胞介导的细胞裂解以及T细胞增殖反应[1]。研究发现HLA-G在结肠癌组织中高表达[2]，其在肿瘤细胞中的异常表达被认为可能是肿瘤细胞得以逃避宿主免疫监视的手段之一[3-4]。HLA-G除了在结肠癌组织中表达外，在人类外周血单个核细胞中也有表达。本实验采用实时荧光定量PCR方法研究HLA-G在结肠癌患者外周血淋巴细胞中的表达，初步探讨其在结肠癌诊断中的应用价值。

1 材料与方法

1.1 标本来源

收集南京市第一医院2010年11月至2011年5月外周血标本共189例。189例中结肠癌患者85例，其中男43例，女42例，年龄48～74岁，平均年龄62岁；经结直肠镜及病理确诊的结肠良性病48例(包括结肠息肉20例，溃疡性结肠炎28例)，其中男26例，女22例，年龄43～78岁，平均61岁；另56名为健康体检者作为正常对照，其中男35名，女21名，年龄56～79岁，平均58岁。

1.2 实验方法

1.2.1 PBMC的分离和总mRNA的提取 抽取2 mL外周血，EDTA-K2抗凝，淋巴细胞分离液分离PBMC。Trizol裂解并提取PBMC细胞总mRNA，通过甲醛琼脂糖变性电泳和紫外分光光度计分析RNA的质量和浓度。

1.2.2 第一链cDNA的合成 EP管中加入5×Reaction Mix 4 μL, Maxima Enzyme Mix 2 μL , RNA 2 μg，加入Nuclease-Free水至20 μL。PCR扩增仪(Thermo)上25℃10 min，50℃15 min，85℃5 min。储存第一链cDNA于4℃冰箱或立即PCR。

1.2.3 引物设计和合成 根据Genebank提供的基因序列，设计引物并比对其特异性。引物由上海生工生物技术公司合成。HLA-G引物如下：上游5′-CTGGTTGTCCTTGCAGCTGTAG-3′;下游5′-CCTTTTCAATCTGAGCTCTTCTTTCT-3′。内参基因β-actin引物如下：上游5′- GGCGGCACCACCATGTACCCT-3′；下游5′-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3′。……