曾 刚，李 威，孟星君

1.南京医科大学附属苏州医院呼吸科(江苏 苏州 215006) 2.苏州市立医院肿瘤诊疗中心肿瘤实验室(江苏 苏州 215006)

CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(CD4+CD25+Foxp3+Treg, Foxp3+Treg)是近年来确定的一类具有免疫调节功能的T细胞亚群，在维持机体免疫自稳、调控免疫应答方面起重要作用。在病理情况下，Foxp3+Treg的增加可以促进肿瘤的生长，抑制抗肿瘤免疫效应。本研究通过检测26例晚期肺癌外周血及胸水中Foxp3+Treg及相关细胞因子的表达情况，同时探讨其临床意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床标本采集 选取2008年3月～2010年3月苏州市立医院呼吸内科收治的26例晚期肺癌患者外周血及胸水作为研究对象。并抽取10例健康志愿者外周血作为对照。所有肺癌患者均经胸水找脱落细胞、支气管镜或胸膜活检等病理诊断证实，患者入组前均未行放疗或化疗。26例肺癌患者中男性15例，女性11例，年龄(44～75)岁，平均年龄(60±4.6)岁。其中8例确诊时已有远处脏器转移。

1.1.2 主要试剂和仪器 淋巴细胞分离液(Ficoll)购自上海生化试剂二厂；Human Regulatory T cell Staining Kit(PE-CD4、FITC-CD25、APC-CD25)购自eBioscience公司；IL-10酶联免疫反应(ELISA)试剂盒购自美国invitrogen公司，FACS Calibur流式细胞仪为BD公司产品。

1.2 方法

1.2.1 外周血及胸水中淋巴细胞悬液制备 抽取肝素抗凝的胸水50～100 ml，2000 r/min离心10 min，上清-80℃冻存备用，沉淀细胞用PBS调整浓度至1×107/ml，缓缓加入装有底层100%(比重1.077)、中间层75%(比重1.055)的淋巴细胞分离液(ficoll)上，经1800 r/min离心20 min，吸取100%液面上的薄层即为富含T细胞的群体。肝素抗凝的外周静脉血4 ml，加入等量PBS稀释后以上述密度梯度离心法分离制备淋巴细胞悬液。所得细胞经缓冲液洗涤后备用。

1.2.2 流……