李鹏飞，周冀衡，罗华元，张建平，黄勇，汤浪涛，陈初，孔宁川

1.云南瑞升烟草技术(集团)有限公司，昆明市高新区海源北路1699号650106

2.湖南农业大学烟草科学与健康重点实验室，长沙市芙蓉区农大路1号410128

3.红云红河烟草(集团)有限责任公司采购中心，昆明市北市区红锦路181号650202

4.上海烟草(集团)公司技术中心，上海市杨浦区长阳路717号200082

不同地区和生态环境下生产的烤烟香气风格和品质存在较大的差异，生态环境对烤烟香气前体物、挥发性香气物质影响方面现已有较多报道[1-5]，生态环境对烤烟香气及品质形成的重要性已越来越被人们所关注。生态因子中光因素对烤烟的香气风格及烟叶品质形成有至关重要的作用，尤其是UV-B(波长为280～320 nm)，而对于烤烟香气风格形成和致香物质积累的原因尚不明确，因此研究UV-B对烤烟致香物质和品质成分的影响尤为重要。UV-B对水稻、番茄、大豆、玉米、小麦、葡萄等作物生长发育、产量、生理及生化影响等方面有了较多的报道[6-13]。国内有部分学者研究了光照强度对烤烟挥发性香气和化学成分的影响[14-15]，而关于紫外线对烤烟香气、品质的影响报道较少。为此，研究了紫外光与烤烟致香物质的关系，旨在为透析特色优质烟叶香气风格形成机理提供依据，为指导特色优质烟叶区域定位和产区布局提供参考。

1 材料与方法

1.1 植物材料

1.1.1 材料培养

采用盆栽试验，供试烤烟品种为K326，塑料盆(高40 cm，直径30 cm)栽培，盆栽土壤为红壤，每盆装风干后土壤约15 kg，行株距为1.2 m×0.5 m，每盆植烟1株，种植于湖南农业大学智能温室大棚内，4月16日移栽，7月5日打顶。按当地优质烟叶生产技术规范进行栽培管理。

1.1.2 试验设计

试验于打顶后第4天开始辐射处理，处理时间共10d，在智能温室大棚内进行。试验共设4个处理(含1个对照)，每处理10株，重复3次。处理方法采用紫外灯管(中国电光源研究所研制，15 W，308 nm)平行悬挂于植株上方，灯管用0.13 mm醋酸纤维素膜过滤以除去280 nm以下波长紫外线的影响，调整紫外灯管与烟株的距离，在环境光照基础上增加UV-B辐照。辐射剂量设定依据文献[14-21]，于每天17∶00～17∶30辐射0.5 h(该时间段自然光照强度已较弱，此时增加UV-B受环境光照影响较少)，连续处理10 d。处理方法:对照(CK):+0.00 W/m2UV-B(环境UV-B强度1.26W/m2);处理A:+0.55 W/m2UV-B;处理B:+1.85 W/m2UV-B;处理C:+3.25 W/m2UV-B[UV-B辐射强度经Cadwell[22]公式(UV-BBE=140.2×读数-4.283)转换为生物有效辐射]。

1.1.3 取样及样品制备方法

分别于处理结束时取样，取各处理烟株上部3～4片、中部9～10片。所取叶片，每片剪取一半立即置于真空冷冻干燥仪下干燥，之后用120目高速粉碎机粉碎，用塑料样品袋密封置于干燥器内保存，用于香气前体物的测定;另一半烟叶置于烘箱中于105℃下杀青15 min，45℃烘干，用120目高速粉碎机粉碎，用塑料样品袋密封置于干燥器内保存，用于常规化学成分的测定。

1.2 分析方法

1.2.1 多酚含量

依据杨虹琦[23]的方法，称取3.0 g冷冻干燥样，放入碾钵中用少量甲醇碾磨后置于圆底烧瓶中，加入30 mL甲醇，水浴加热回流2 h，过滤后用甲醇定容至50 mL，吸取供试液20 μL注入液相色谱仪，外标法定量。仪器:美国Dionex Summit HPLC，170U可见-紫外检测器;色谱柱为Diamonsil-ODS-C18(5 μm，250 mm×4.6 mm i.d.);流动相为甲醇A与0.05 mol·L-1磷酸二氢钾水溶液B，梯度洗脱。程序:10%A+90%B(10 min)→80%A+20%B(5 min)→10%A+90%B(10 min)，流速1 mL·min-1;检测波长326 nm。绿原酸标准品为Sigma公司产品(纯度大于95%)，芸香苷标准品为Fluka公司产品(纯度大于90%)。

1.2.2 类胡萝卜素含量

依据杨虹琦[24]的方法，准确称取样品1.0 g冷冻干燥样，剪碎置于碾钵，加入丙酮:乙酸乙酯(2∶1)10 mL和0.1 mL 0.01%二丁基羟基甲苯(BHT)，反复碾磨3次，转入100 mL带塞三角瓶超声15 min，布氏漏斗抽滤后定容至50 mL，低温、避光保存备用。分析仪器同上;进样量20 μL，流动相A为乙酸乙酯，B为90%乙腈;采用梯度洗脱，流速0.6 mL·min-1;检测波长为450 nm;用外标法测定β-类胡萝卜素和叶黄素含量。

1.2.3 叶绿素和常规化学成分

依照Arnon[25]的方法测定烟叶叶绿素含量。参照肖协忠[26]的方法测定样品中总氮、烟碱、水溶性总糖、还原糖和钾。

1.2.4 数据处理

采用SPSS 13.0统计软件进行数据的统计分析，用LSD法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 增强UV-B辐照对烤烟叶绿素含量的影响

不同强度UV-B辐射烤烟后烟叶叶绿素含量见表1。由表1可知，在紫外辐射10 d后，各处理烟叶叶绿素含量变化较大，部位间的变化趋势也不一致。方差分析可知，3个处理上部叶和中部叶的叶绿素含量与对照间差异均达到极显著水平。上部叶在不同的UV-B辐射10 d后烟叶叶绿素a和叶绿素b含量均低于对照，+3.25 W/m2的处理烟叶总叶绿素含量降低幅度最大达58.10%，其次为+1.85 W/m2的处理较小，+0.55 W/m2的处理降幅最小为10.98%。这表明增加UV-B强度会较严重地伤害烤烟上部叶，造成叶绿素含量急剧下降，随着UV-B强度增大上部叶叶绿素呈曲线下降(见图1)，叶绿素a与叶绿素b的降低幅度相差不大。3个处理的中部叶受UV-B辐射10 d后叶绿素含量与上部叶变化情况不同，叶绿素a和叶绿素b含量比对照大幅度升高，总叶绿素含量按升高幅度排序为:+1.85 W/m2处理＞+3.25 W/m2处理＞+0.55 W/m2处理，并且叶绿素b的升高幅度大于叶绿素a，这表明增强UV-B能促进烤烟中部叶的叶绿素合成，随着UV-B强度的增加，烟叶叶绿素含量呈先升高后降低的曲线变化趋势，且UV-B处理更有利于促进中部叶叶绿素b的合成。

2.2 增强UV-B辐照对烤烟类胡萝卜素含量的影响

不同强度UV-B辐射烤烟10 d后烟叶叶绿素含量见表2。从表2中可知，UV-B辐射10 d后，3个处理上部叶β-类胡萝卜素和叶黄素含量降低，而中部叶β-类胡萝卜素和叶黄素含量均升高。方差分析发现+0.55 W/m2处理与对照的总类胡萝卜素含量差异不明显，+1.85 W/m2和+3.25 W/m2处理与对照的差异达极显著水平。从所有处理的上部叶来看，对照的总类胡萝卜素含量最高，3个处理比对照的总类胡萝卜素含量降低幅度分别为:33.07%，6.67%，2.40%，这表明对成熟期烤烟上部叶增强UV-B处理会抑制类胡萝卜素的合成，随UV-B强度的增强类胡萝卜素呈曲线下降趋势(见图2)，较低UV-B强度时对叶黄素和β-类胡萝卜素抑制作用较小，β-类胡萝卜素受UV-B抑制影响大于叶黄素。从中部叶来看，类胡萝卜素含量由高到低为:+1.85 W/m2处理＞+0.55 W/m2处理＞+3.25 W/m2处理＞对照，这表明对成熟期烤烟中部叶施加UV-B能促进类胡萝卜素的合成，随着UV-B强度的增强类胡萝卜素呈曲线下降趋势，强度较低对促进β-类胡萝卜素升高影响较大，强度较高时对促进叶黄素升高影响较大。

图1 UV-B辐照烤烟叶绿素含量的变化

2.2 增强UV-B辐照对烤烟多酚类物质含量的影响

不同强度UV-B辐射10 d后烤烟叶内绿原酸、芸香苷含量变化见表3。由表3可知，上部叶的绿原酸和芸香苷在UV-B辐照10 d后含量升高，而中部叶的绿原酸和芸香苷则下降。方差分析表明，上部叶绿原酸和芸香苷含量比对照显著升高，且升高的幅度为+3.25W/m2处理＞1.85 W/m2处理＞+0.55 W/m2处理，这表明对成熟期烤烟上部叶增加UV-B辐射能促进烟叶多酚含量的升高，增幅与UV-B强度成正比，随着UV-B强度的增大，烟叶多酚含量呈曲线上升趋势(见图3)，芸香苷上升的幅度大于绿原酸。而中部叶的绿原酸和芸香苷含量在UV-B辐射10 d后则有较大幅度的下降，下降幅度与UVB强度成正比，随着UV-B强度增大，烟叶多酚含量呈曲线下降趋势，绿原酸比芸香苷下降的幅度大，表明烤烟中部叶多酚合成更易受UV-B的抑制影响。

图2 增强UV-B辐照烤烟类胡萝卜素含量的变化

表2 增强UV-B辐照对烤烟类胡萝卜素含量的影响

表3 增强UV-B辐照对烤烟烟叶多酚含量的影响

2.3 增强UV-B辐照对烤烟主要化学成分的影响

2.3.1 增强UV-B辐照对烤烟总氮、蛋白质和烟碱含量的影响

UV-B辐射后烤烟总氮、蛋白质和烟碱含量见表4。从表4中可以看出，不同强度的UV-B使上部叶处理的总氮、蛋白质、烟碱含量极显著低于对照，这表明增强UV-B会抑制烤烟上部叶总氮、蛋白质、烟碱的合成。随着UVB强度增大烟叶总氮、蛋白质、烟碱呈曲线下降趋势，UVB强度越大总氮、蛋白质和烟碱下降幅度越大。从中部叶的总氮、蛋白质、烟碱含量来看，变化情况与上部叶不同，中部叶受UV-B增强的影响烟碱含量比对照升高，+0.55 W/m2和+1.85 W/m2处理的总氮和蛋白质与对照差异不明显，+3.25W/m2处理显著高于对照，随着UV-B

强度增大，中部叶总氮、蛋白质和烟碱的含量都呈曲线上升趋势，UV-B强度较小时其影响不大。

2.3.2 增强UV-B辐照对烤烟总糖和还原糖含量的影响

图3 增强UV-B辐照烤烟多酚类物质含量的变化

表4 增强UV-B辐照对烤烟总氮、蛋白质和烟碱含量的影响

表5 增强UV-B辐照对烤烟总糖、还原糖和钾含量的影响

不同强度UV-B辐射烤烟烟叶可溶性总糖和还原糖的含量见表5。由表5可知，成熟期烤烟总糖和还原糖在UV-B辐射10 d后含量下降。从各处理的上部叶来看，3个处理总糖和还原糖含量比对照显著降低，随着UV-B强度的增加，上部叶总糖和还原糖含量都呈曲线下降，可溶性总糖的下降幅度大于还原糖，两糖受UV-B影响的下降幅度与强度成正比。从各处理的中部叶来看，与上部叶一致，也表现为处理比对照的含量显著降低，随着UV-B强度的增加，中部叶总糖和还原糖都呈曲线下降趋势，还原糖下降幅度大于可溶性总糖，在+0.55 W/m2UV-B之上再增加强度对可溶性总糖和还原糖的降幅影响不大。

2.3.3 增强UV-B辐照对烤烟钾含量的影响

不同强度UV-B辐射烤烟烟叶钾含量见表5。由表可知，成熟期烤烟在UV-B辐射10 d后，方差分析表明，各处理上部叶的钾含量比对照都有所升高，上部叶各处理与对照的钾含量差异极显著，中部叶+3.25 W/m2处理与对照的钾含量差异不明显。随着UV-B强度的增加，上、中部叶钾含量均呈曲线上升趋势，增加UV-B强度越低时钾含量升高幅度越大。

3 结论与讨论

增强UV-B辐照会抑制烤烟上部叶的叶绿素和类胡萝卜素合成，随着UV-B强度增大上部叶叶绿素和类胡萝卜素含量呈逐渐下降趋势，增加UV-B辐照能促进烤烟中部叶叶绿素和类胡萝卜素的合成，随着UV-B强度的增加，烟叶叶绿素和类胡萝卜素呈曲线变化趋势。这与薛慧君[27]的研究，增强紫外-B辐射反枝苋其叶绿素、类胡萝卜素含量降低，叶片紫外吸收物质含量增加的结果一致。但与蒋霞敏的研究结果不同，蒋霞敏[28]用不同剂量的紫外线辐射雨生红球藻，辐射后细胞叶绿素和类胡萝卜素含量增加，随着辐射时间的延长而加大。原因可能是由于增加UV-B对上部烟叶叶绿体结构造成破坏影响了质体色素的合成，也可能是UV-B增强导致色素的光降解速度加快，质体色素分解过多所致。

对成熟期烤烟上部叶施加UV-B能促进烟叶多酚含量的提高，增幅与UV-B强度成正比，但会抑制中部叶的绿原酸和芸香苷的合成，且降幅与UV-B强度成正比，随着UV-B强度增加烟叶多酚含量呈曲线下降趋势。与黄勇[33]的研究结果部分一致，因为植物表层及液泡内所富集的大量酚类次生代谢产物(如类黄酮、苯丙烷类衍生物等)能吸收UV-B，引起类黄酮合成途径的苯丙氨酸裂解酶和查尔酮合成酶以及其他分支点的酶积累或活性加强[30]，但是该试验表明增强UV-B对中部叶的多酚类物质合成代谢有不利影响，与Zucker[32]的研究结果一致，这可能与中部叶受到的UV-B强度弱于上部叶，多酚氧化酶和过氧化物酶含量升高，导致多酚氧化分解所致。

增强UV-B使上部和中部烟叶总糖和还原糖含量降低，随着UV-B强度的增加，上、中部叶总糖和还原糖含量都呈曲线下降趋势，中部叶在+0.50 W/m2UV-B之上再增加强度对可溶性总糖和还原糖的降幅影响不大。这与黄勇[34]研究结果一致。但Zu Yanqun[35]发现小麦品种的小麦籽粒品质对UV-B辐射的响应中有7个品种总糖和粗淀粉下降，3个品种上升，另外UV-B辐射可降低番茄、甘蓝中葡萄糖、蔗糖、淀粉的含量，而使甜菜根中蔗糖含量上升[36]，可能UV-B辐射对碳水化合物的影响在作物种类和品种间有一定的差异性。另外，增强UV-B对烤烟上部叶总氮、蛋白质、烟碱的合成不利，随着UV-B强度增大呈曲线下降趋势，UV-B增强对中部叶总氮、蛋白质、烟碱合成有利，随着UV-B强度的增大，总氮、蛋白质、烟碱的含量都呈曲线上升趋势，UV-B强度较低时促进作用较小。原因可能是UV-B对总氮和烟碱的影响主要是通过氮代谢和烟碱合成中酶蛋白的调节来实现的，UV-B抑制了蛋白质的合成，降低了总氮中蛋白质和氨基酸的含量，另外抑制了烟碱合成中的关键酶，从而导致上部叶总氮和烟碱含量的降低，但是中部叶总氮、蛋白质和烟碱含量却随着UV-B增强而提高，可能是中部叶受到UV-B辐照强度较弱，对其合成起到刺激作用，具体原因还有待深入研究。UV-B增强导致上、中部叶的钾含量升高，随着UV-B强度的增加，上、中部叶钾含量均呈曲线上升。原因可能是钾能调节气孔开放、改善烟草次生代谢，逆境导致了钾素在烟叶的迅速积累，也可能是由于UV-B导致更多的酶活化需要钾量更多所致。

本试验增强UV-B对于烤烟香气前体物和化学成分的影响只限于烟株成熟初期，UV-B对于烤后烟叶香气成分组成及含量、外观与内在品质的影响还有待进一步研究。由于烤烟的主要香气前体物及化学成分与UV-B强度密切相关，适当增强UV-B有利于烤烟中部叶香气品质的提高。因此，烤烟种植应选择适宜特色优质烤烟生长的生态区域。

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