黎小正, 童桂香, 韦信贤, 吴祥庆, 陈 康

(1. 广西渔业病害防治环境监测和质量检验中心, 广西 南宁 530021; 2. 钦州市钦南区水产畜牧局, 广西 钦州535000)

香港巨牡蛎ISSR-PCR反应体系的建立及优化

黎小正1, 童桂香1, 韦信贤1, 吴祥庆1, 陈 康2

(1. 广西渔业病害防治环境监测和质量检验中心, 广西 南宁 530021; 2. 钦州市钦南区水产畜牧局, 广西 钦州535000)

以香港巨牡蛎(Crassostrea hongkongensis)基因组DNA为模板, 采用正交设计及单因素比较试验,分别对Mg2+、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶和DNA模板浓度的PCR原料进行优化, 并通过温度梯度PCR, 筛选适宜的退火温度。确立了香港巨牡蛎的最适ISSR-PCR反应体系： 25 μL反应体系中含PCR 1×Buffer, 2.5 mmol/L Mg2+、0.2 mmol/L dNTPs、0.2 μmol/L 引物、1.2 UTaqDNA 聚合酶、20 ng DNA模板。反应程序为： 94℃预变性5 min; 94℃变性1 min, 48～54℃(随引物而确定)退火1 min, 72℃延伸1.5 min, 35个循环; 72℃延伸10 min。利用所建立的 ISSR-PCR反应体系对香港巨牡蛎基因组DNA进行扩增, 获得了清晰、重复性好、多态性高的DNA谱带, 为进一步利用ISSR分子标记研究香港巨牡蛎的遗传多样性奠定了基础。

香港巨牡蛎(Crassostrea hongkongensis); ISSR-PCR; 体系优化

香港巨牡蛎 (Crassostrea hongkongensis), 属于双壳纲(Bivalvia), 珍珠贝目(Pteriodae), 牡蛎科(Ostreidae)[1], 俗称大蚝, 是暖水性双壳类软体动物,以滤食海水浮游生物为主, 其肉质鲜美、营养丰富,素有“海底牛奶”之称, 是中国南方沿海主要的经济贝类和出口海产品, 也是作为海洋重金属等污染的重要指示生物[2]。钦州湾海岸曲折、咸淡水交汇、滩涂广阔、十分有利于牡蛎的繁殖和生长, 茅岭海域也因产上乘品质的牡蛎而被农业部授予“中国牡蛎之乡”的荣誉称号。钦州市的牡蛎养殖逐年增多, 苗种采集及成品产量大幅增长, 随着人工开发和自然环境的变化, 香港巨牡蛎的生长发生了一些变化, 甚至出现种质退化和变异现象[3]。……