赵国燕,刘万顺,韩宝芹,梁 晔

(中国海洋大学海洋生命学院,山东青岛266003)

低分子量氨基糖及其衍生物对角膜细胞生长影响的研究*

赵国燕,刘万顺**,韩宝芹,梁 晔

(中国海洋大学海洋生命学院,山东青岛266003)

体外培养兔角膜上皮细胞和基质细胞,采用显微观察和MTT相结合的方法分析低分子量氨基糖(包括壳寡糖(chitosan)、羧甲基壳寡糖(Carboxymethyl chitosan oligosaccharide)、羧甲基甲壳寡糖(Carboxymethyl chitin oligosaccharide)、N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetyl-glucosamine))对细胞生长的影响。结果在0～1000μg/mL浓度范围内4种氨基糖对角膜上皮细胞和基质细胞均没有细胞毒性,且均能促进角膜上皮细胞的生长,以壳寡糖和羧甲基甲壳寡糖效果最佳,二者与对照组相比均具有显著性差异(P<0.05)。壳寡糖、羧甲基甲壳寡糖和N-乙酰氨基葡萄糖能明显促进角膜基质细胞的生长,与对照组相比具有显著性差异(P<0.05),其中壳寡糖的促进作用最明显。提示低分子量氨基糖可适用于角膜细胞促生长的培养,为壳聚糖衍生物材料用于眼科研究提供一定的实验依据。

壳寡糖;羧甲基甲壳寡糖;角膜上皮细胞;角膜基质细胞

甲壳素是自然界含量仅次于纤维素的第二大生物大分子多糖,经脱乙酰基可制得壳聚糖,目前在医药卫生、生物医用材料、健康食品、精细化工、生物工程等领域都有广泛的研究。甲壳素经酸、生物酶等选择性可控降解,可制得甲壳寡糖和单糖;壳聚糖经酸或生物酶选择性降解,可制得壳寡糖;寡糖经羧甲基化可制得羧甲基甲壳寡糖和羧甲基壳寡糖。

氨基寡糖及单糖对于细胞生长作用的研究有较多报道[1-3],如对胰岛B细胞、成骨细胞生长均有明显的促进作用,并且能够促进神经干细胞的分化。到目前为止低分子量氨基糖及其衍生物对角膜细胞生长影响的报道较少。

本实验以兔角膜细胞为研究对象,从细胞水平上评价壳寡糖(COS)、羧甲基壳寡糖(CMCOS)、羧甲基甲壳寡糖(CMCTOS)、N-乙酰氨基葡萄糖(NA G)对角膜细胞生长的影响,探索低分子量氨基糖在角膜细胞培养中的应用价值,同时为壳聚糖类生物材料应用于眼科研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

1.1.1 实验材料与试剂

(1)4种低分子量氨基糖:壳寡糖(COS,MW=1413Da,脱乙酰度90.15%),羧甲基壳寡糖(CMCOS,MW=6546Da,脱乙酰度88.68%,取代度67.31%),羧甲基甲壳寡糖(CMCTOS,MW=1961Da,脱乙酰度29.88%,取代度70.87%),N-乙酰氨基葡萄糖(NAG),以上材料均由本实验室制备并纯化。L929细胞毒性试验结果显示4种氨基糖均没有细胞毒性,生物相容性良好。使用时分别加细胞培养基溶解,经0.22μm滤膜过滤除菌,并稀释至不同浓度。

(2)实验动物:新西兰兔,1月龄,雌雄各半,购自山东省农科院。

(3)实验试剂:DMEM培养基(Gibco)、DMEM/F12培养基(Gibco)、小牛血清(Hyclone)、胰酶(Gibco)、MTT(Sigma)。二甲基亚砜(DMSO)和配制D-Hanks液所需的化学试剂均为分析纯。

1.1.2 实验仪器 HF Safe 760S超净工作台、HF90 CO2细胞培养箱(上海力申科学仪器有限公司),IX 70 O-lympus倒置显微镜(日本Olympus),LabsystemsMultiskan Mk3酶标仪(芬兰雷勃),96孔培养板(Costa)。

1.2 实验方法

1.2.1 兔角膜上皮细胞和基质细胞的分离与传代培养

麻醉处死动物,无菌取出眼球,去除冗余组织,无菌生理盐水冲洗后,放入含2 000 U/mL的硫酸庆大霉素生理盐水中浸泡20 min,于无菌条件下沿角膜缘取下角膜,解剖镜下将其组织剥离,分离出上皮层、基质层、内皮层3部分,将上皮层和基质层分别剪成2 mm×2 mm小组织块,分别贴附于25 mL的细胞培养瓶中,置于37℃、5%CO2培养箱中贴壁4 h,然后加入含15%小牛血清的DMEM/F12培养基1 mL,继续培养。2 d后补加培养基至3 mL,每3 d换液1次。当组织块周围有大量细胞迁出,并出现大量细胞融合时,用0.25%胰酶液消化并传代培养,分别制得大量角膜上皮细胞和基质细胞。

1.2.2 MTT法测定不同氨基糖对角膜上皮细胞生长的影响 取传代培养1～2次的角膜上皮细胞制备细胞悬液,调整细胞浓度为105/mL,接种于96孔板中,每孔接种200μL,置于细胞培养箱中培养。24 h后吸出原培养液,对照组加200μL常规细胞培养液,实验组分别加入含有不同氨基糖的细胞培养液200μL,氨基糖的终浓度分别为62.5、125、250、500和1 000 μg/mL,空白对照组仅加相应的培养液,于37℃,5%CO2培养箱中继续培养。分别于2和4 d后,在倒置显微镜下观察细胞生长状态、拍照。加入5 mg/mL的MTT液20μL继续孵育4 h,吸去孔中液体,加入150μL二甲基亚砜,于492 nm处比色测定。实验重复3次。

1.2.3 MTT法测定不同氨基糖对角膜基质细胞生长的影响 取传代培养3～4代的角膜基质细胞,消化制备细胞悬液,以2×104/mL的细胞浓度接种于96孔板中,每孔接种200μL;其余步骤同1.2.2。实验重复3次。

1.2.4 数据分析 结果用mean±SD表示。应用SPSS 13.0统计分析软件,采用One-way ANOVA进行多组样本均数的比较,组间比较采用Duncan’s法,显著性界值设定为P<0.05。

2 结果

2.1 角膜上皮细胞和基质细胞的体外培养

组织培养24 h时角膜上皮组织边缘即有不规则细胞迁出(见图1)。培养至48 h时组织边缘迁出较大面积细胞生长晕,细胞呈多边形,胞浆丰富,细胞之间排列紧密。至96 h时多数细胞融合。原代上皮细胞经传代培养24 h时细胞贴壁并伸展,后续培养细胞不断增殖,到144 h细胞铺满瓶底,并出现细胞融合现象(见图2)。

图2 传代培养角膜上皮细胞(×100)Fig.2 Subcultured corneal epithelial cells(×100)

组织培养72 h角膜基质细胞缓慢从组织块中迁出(见图3),细胞呈梭形或成纤维状,随培养时间延长细胞不断增殖,到144 h时细胞融合,并呈现明显的生长极性。

图3 角膜基质层迁出基质细胞(×100)Fig.3 The corneal stroma moved out stromal cells(×100)

2.2 低分子量氨基糖对角膜上皮细胞生长的影响

2.2.1 低分子量氨基糖对角膜上皮细胞生长状态的影响 镜下可见,各组细胞形态良好,细胞饱满,胞浆丰富,培养2和4 d时COS、NAG和CMCTOS组细胞密度均大于对照组。随培养时间延长,细胞密度不断增大,培养至4 d时(见图4)COS各组、NA G低浓度组和CMCTOS低浓度组细胞铺满96孔板孔底,细胞伸展平铺倾向略大于2 d时。CMCOS各组与对照组细胞密度无明显差异。

图4 角膜上皮细胞培养4 d时各组细胞形态(×100):Fig.4 The cells morphology of every group when cultured for 4 days(×100)

2.2.2 MTT法测定低分子量氨基糖对角膜上皮细胞生长的作用 MTT法测定结果(见图5)显示NA G、COS、CMCOS和CMCTOS在本实验浓度下对角膜上皮细胞生长均没有毒性,且对细胞均有一定的促增殖作用,以低浓度下各种糖对促细胞生长较为明显,但COS在较高浓度均能促进角膜上皮细胞的生长。NA G、CMCOS、CMCTOS的最适浓度为62.5 μg/mL,COS为250μg/mL,与对照组相比均具有显著性差异(P<0.05)。此外随培养时间,2 d时COS的促增长作用表现最明显,4 d时CMCTOS对细胞促生长作用最明显(见图6)。

图5 培养2、4 d时不同浓度氨基糖对角膜上皮细胞生长的影响Fig.5 The effect of different concentrations of saccharides on the growth of corneal epithelial cells cultured for 2 or 4 days

图6 培养4 d时角膜基质细胞生长状态(×100)Fig.6 The cells morphology of every group when cultured for 4 days(×100)

2.3 低分子量氨基糖及其衍生物对角膜基质细胞生长的影响

2.3.1 低分子量氨基糖及其衍生物对角膜基质细胞生长状态的影响 用不同浓度的糖培养液培养角膜基质细胞,分别于2和4d时观察角膜基质细胞的生长状态,结果发现细胞生长良好,细胞呈长梭形、胞浆丰富、胞体透明。COS各组、NAG低浓度组和CMCTOS低浓度组细胞密度明显高于不加糖的对照组(见图6),4 d时实验组细胞铺满孔底,而对照组仍未铺满孔底。CMCOS各组细胞形态与其他组相似,但细胞密度与对照组无明显差异。

2.3.2 MTT法测定低分子量氨基糖对角膜基质细胞生长的作用 MTT法测定结果(见图7)显示4种低分子量氨基糖在0～1 000μg/mL范围内对角膜基质细胞生长均没有细胞毒性。细胞培养2 d时,COS和NAG对细胞生长有明显的促进作用(P<0.05),其最适浓度均为125μg/mL。4 d时COS和CMCOT明显地促进细胞的生长(P<0.05),最适浓度均为125μg/mL。CMCOS对角膜基质细胞生长无明显的作用。

图7 培养2、4 d时不同浓度氨基糖对角膜基质细胞生长的影响Fig.7 The effect of different concentrations of saccharides on the growth of corneal stromal cells cultured for 2 or 4 days

3 讨论

随着组织工程的兴起,组织工程角膜的制备成为研究的热点[4]。体外培养角膜细胞不仅为组织工程角膜提供种子细胞,更为支架材料的筛选以及药物检测提供细胞来源[5-6]。随着研究的深入角膜细胞的体外培养取得良好的进展[7-8],但如何获得批量、高活性且与体内细胞相同的角膜细胞依然是需要解决的问题。本实验采用组织贴壁法体外原代培养角膜上皮细胞和角膜基质细胞,经传代后获得大量高活性的角膜细胞,为后续材料的细胞评价提供了丰富的细胞来源。

研究发现壳寡糖及其单糖具有较好的促细胞生长的作用。房子等[9]研究发现壳寡糖对异丙肾上腺素损伤的心肌细胞具有显著的保护作用,且能抑制心肌细胞凋亡。不同分子量的壳寡糖对胰岛B细胞体外增殖具有明显的促进作用,能明显促进成骨细胞增殖,能够促进神经干细胞的分化和神经生长。

本研究发现壳寡糖、N-乙酰氨基葡萄糖、羧甲基壳寡糖、羧甲基甲壳寡糖对角膜上皮细胞和角膜基质细胞生长均没有毒性,并且壳寡糖、N-乙酰氨基葡萄糖和羧甲基甲壳寡糖能明显地促进角膜2种细胞的生长。提示壳寡糖及其衍生物可用于角膜细胞的培养。

近年来在组织工程角膜的研究开发中,支架材料的筛选是其研究的重要方面。壳聚糖及其大分子衍生物具备良好的生物相容性和可降解性,不少学者致力于其在组织工程角膜中的应用研究,并取得良好的成果。高兴爽等[10]研究发现羟丙基壳聚糖对角膜基质细胞生长有一定的促进作用,采用羟丙基壳聚糖、明胶、硫酸软骨素共混制得的组织工程角膜膜片具有良好的细胞相容性。王诗路等[11]用羟丙基壳聚糖、明胶和硫酸软骨素按一定比例共混制备三维支架材料,并接种角膜基质细胞,细胞在材料上生长良好,兔眼内植入实验效果亦佳。本研究结果表明低分子氨基糖及其衍生物对角膜上皮细胞和基质细胞生长均没有细胞毒性,且有一定的促细胞生长作用,为壳聚糖类材料在组织工程角膜中的应用提供了良好的理论支撑。

[1] 刘冰,秦贞奎,林祥梅,等.不同分子量壳寡糖对促胰岛细胞增殖、胰岛素分泌及调节餐后血糖的作用[J].世界华人消化杂志,2009,17(1):36-42.

[2] 金黎明,魏长征,田文杰,等.壳寡糖及其衍生物对体外培养成骨细胞增殖的作用特点[J].中国组织工程研究与临床康复,2008,12(19):3637-3640.

[3] 杨宇民,林社裕,刘梅,等.壳寡糖对神经干细胞分化的影响[J].交通医学,2007,21(6):623-626.

[4] 范先群.组织工程角膜的研究现状和存在的问题[J].上海交通大学学报:医学版,2008,28(6):619-62.

[5] Federico Castro-Munozledo.Corneal epithelial cell cultures as a tool for research,drug screening and testing[J].Experimental Eye Research,2008,86:459-469.

[6] Liu Jingbo,Song Ge,Wang Zhichong,et al.Establishment of a corneal epithelial cell line spontaneously derived from human limbal cells[J].Experimental Eye Research,2007,84:599-609.

[7] 张敏,钟良玉.角膜上皮细胞体外培养的研究进展[J].中国中西医眼科杂志,2008,18(1):56-58.

[8] 任玫卿,栾洁.兔角膜上皮细胞体外原代培养方法的研究[J].东南大学学报:医学版,2008,27(2):90-94.

[9] 房子,韩宝芹,刘万顺,等.壳寡糖及其衍生物对大鼠受损心肌细胞和组织的保护作用[J].高技术通讯,2005,15(11):96-100.

[10] 高兴爽,刘万顺,韩宝芹,等.壳聚糖基角膜细胞载体的制备及其细胞相容性[J].生物工程学报,2008,24(8):1381-1386.

[11] 高兴爽,刘万顺,韩宝芹,等.羟丙基壳聚糖的制备、表征及其对角膜细胞生长的影响[J].中国海洋大学学报:自然科学版,2007,37(增刊Ⅱ):131-134.

[12] Wang Shilu,Liu Wanshun,Han Baoqin,et al.Study on a hydroxypropyl chitosan-gelatin based scaffold for corneal stroma tissue engineering[J].Applied Surface Science,2009,255:8701-8705.

The Effect of Low Molecular Amino Saccharides and Their Derivatives on Corneal Cells Growing

ZHAO Guo-Yan,LIU Wan-Shun,HAN Bao-Qin,LIANG Ye
(College of Marine Life Sciences,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

Rabbit corneal epithelial cells and stromal cells were cultured in vitro.The effect of low molecular weight amino saccharides which included chitosan,carboxymethyl chitosan oligosaccharide,carboxymethyl chitin oligosaccharide and N-acetyl-glucosamine on cells were observed by using microscopic observation and the MTT method.The results showed that,in the concentration range of 0 to 1 000μg/mL,these four kinds of amino saccharides were not cytotoxic on corneal epithelial cells and stromal cells.At the same time,they could promote the growth of corneal epithelial cells.Chitosan and carboxymethyl chitin oligosaccharide were the better.There were significant differences,compared with the control group as well(P<0.05).Chitosan,carboxymethyl chitin oligosaccharide and N-acetyl-glucosamine could significantly promote the growth of corneal stromal cells,while chitosan was the most obvious.There were significant differences,compared with the control group(P<0.05).The results promptd that low molecular weight amino saccharides could be applied to promote the growth of corneal cells in vitro culture and provide some experimental basis for chitosan derivative materials used for ophthalmic research.

chitosan;carboxymethyl chitin oligosaccharide;corneal epithelial cells;corneal stromal cells

R99

A

1672-5174(2011)03-052-05

国家高技术研究发展计划重点项目(2007AA091603,2006AA02A132)资助

2010-02-23;

2010-04-28

赵国燕(1986-),女,硕士生。E-mail:yanguoz@126.com

**通讯作者:E-mail:wanshunliu@hotmail.com

责任编辑 于 卫