张清杰，谢洁，果旗，江帆，王彦斐，王雄，聂长明

（1.南华大学 化学化工学院，湖南 衡阳 421001；2.北京中检维康技术有限公司，北京 100044）

免疫亲和柱
——高效液相色谱法检测乳制品中玉米赤霉醇及其类似物

张清杰1，谢洁1，果旗2，江帆2，王彦斐2，王雄2，聂长明1

（1.南华大学 化学化工学院，湖南 衡阳 421001；2.北京中检维康技术有限公司，北京 100044）

采用高效液相色谱法检测牛奶和奶粉中的6种玉米赤霉醇及其类似物，该方法准确、可靠、灵敏度高。样品用乙腈提取，经免疫亲和柱净化后，用高效液相色谱-紫外检测器检测。结果表明，牛奶和奶粉中添加6种玉米赤霉醇及其类似物回收率均为80%～110%，变异系数均小于12%。

玉米赤霉醇；类似物；高效液相色谱法；免疫亲和柱

0 引 言

玉米赤霉醇是镰刀霉菌次生代谢产物——玉米赤霉烯酮的还原产物，具有弱雌激素功能，作为生长促进剂用于反刍动物，具有促进蛋白质合成的作用[1]。动物实验表明，玉米赤霉醇对促性腺激素结合受体等有抑制作用[2]。欧盟于1996年禁止在食用动物上使用玉米赤霉醇[3],2002年，我国农业部规定玉米赤霉醇禁止用于所有食品动物，在所有食用组织不得检出[4]。玉米赤霉烯酮及其代谢产物——α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和β-玉米赤霉醇均可能污染饲料，造成动物产品中检出玉米赤霉醇残留。

目前玉米赤霉醇及其类似物的检测方法主要有薄层色谱法[5-6]，高效液相色谱法[7-8]，气相色谱/质谱联用方法[9]，液相色谱/质谱联用方法[10-12]和免疫测定方法[13]等。本文研究了免疫亲和柱净化，高效液相色谱—紫外法测定牛奶和奶粉中的玉米赤霉醇及其类似物的残留量，该方法快速，简单，可靠，准确，灵敏。

1 材料与方法

（1）仪器与试剂：高效液相色谱仪（HITACHI），紫外检测器（HITACHI），高速离心机，6种玉米赤霉醇类标准品。

（2）HPLC-UV条件：色谱柱：Cloversil-C18，4.6 mm×250 mm，流动相：乙腈-甲醇-水（体积比为43∶7∶50）,流速：0.80 mL/min，柱温：室温，检测器：紫外检测器，波长为265 nm,进样量为20 μL。

（3）玉米赤霉醇及其类似物6种标准品的配制与标准曲线的建立：6种混和标准品用色谱级甲醇配制，质量浓度分别为5,10,20,50,100 μg/L，供液相色谱检测，建立标准曲线。

1.1 样品前处理

1.1.1 牛奶

（1）提取。准确量取牛奶样品10.0 mL，准确加入10.0 mL乙腈，摇床震荡提取20 min，然后以转速4 000 r/min离心10 min；准确吸取上清液10.0 mL，用40 mL纯水稀释，用玻璃纤维滤纸过滤，收集滤液于干净烧杯中。

（2）净化。 将上述滤液16.0 mL（2.0 mL样品），以1滴/秒的流速全部通过玉米赤霉醇免疫亲和柱，直至空气流经亲和柱，随后用10.0 mL纯水以1～2滴/s的流速淋洗亲和柱，直至空气流经亲和柱，将玻璃小管置于亲和柱下，用1.0 mL甲醇以1滴/s淋洗亲和柱，将所有样品淋洗液收集于玻璃测试管中，于60℃氮气下吹干，然后用流动相定容500 μL，注入HPLC检测。

1.1.2 奶粉

准确称取5 g奶粉，加入50 mL温水（50℃）溶解充分混匀。然后按照1.1.1牛奶的试验方法操作。

1.2 添加回收实验

分别选择牛奶和奶粉样品进行添加回收实验，牛奶样品分别添加质量浓度为5,10,20 μg/L；奶粉样品分别添加质量分数为15,30,50 μg/㎏。每个实验做5组平行，计算回收率和变异系数。

2 结果与分析

2.1 标准曲线、色谱图

六种玉米赤霉醇类混和标准品的质量浓度均为：5,10,20,50,100 μg/L，建立标准曲线，以各组分浓度与其色谱峰面积进行线性回归,呈良好线性关系（表1），质量浓度为50 μg/L色谱如图1所示。

表1 线性回归方程、相关系数和检出限

2.2 方法回收率、精密度

牛奶和奶粉中添加回收结果为：牛奶中6种玉米赤霉醇类激素药物的平均回收率为80%～110%（n=5）,相对标准偏差为4.0%～12%（表2）,奶粉中6种玉米赤霉醇类激素药物的平均回收率为80%～110%（n=5）,相对标准偏差为3.0%～11%（表3），这表明该方法稳定性强、重现性好。

采用免疫亲和柱进行样品净化前处理，能够很大的提高样品的检测灵敏度，牛奶样品浓缩了5倍，奶粉样品浓缩了25倍。实验中液相色谱灵敏度能够达到10 μg/L，因此,牛奶的检测灵敏度为2.0 μg/L，奶粉的检测灵敏度为0.4 μg/kg。

牛奶样品中添加质量浓度为30 μg/L的检测色谱图如图2所示。

表2 牛奶样品的添加回收率和精密度

表3 奶粉样品的添加回收率和精密度

3 结 论

文章采用免疫亲和柱净化-高效液相色谱-紫外法检测牛奶和奶粉中玉米赤霉醇及其类似物的残留量，样品前处理简单，免疫亲和柱净化效果明显，检测结果精密度高,重现性好，该方法适用于牛奶和奶粉中的玉米赤霉醇及其类似物的快速检测。

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[3]Council Directive 96/22/EC of 29 April 1996 Concerning the Prohibition on the Use in Stockfarming of Certain Substances Having a Hormonal or Thyreostatic Action and of Beta-agonists（1996）.Off.J.Eur.Commun.L125：3-9.

[4]中华人民共和国农业部第235号公告.动物性食品中兽药最高残留限量.2002：12.

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Simultaneous determination of zeranol and its analogs in milk and powder milk by high performance liquid chromatography with immunoaffinity clean-up column

ZHANG Qing-jie1,XIE Jie1,GUO Qi2,JIANG Fan2，WANG Yan-fei2,WANG Xiong2,NIE Chang-ming1
（1.University of South China,Hengyang 421001,China；2.Clover Technology Group Limited,Beijing 100044，China）

This work reports a precise,reliable and sensitive multi-residue method for the simultaneous determination of zeranol and its analogs in milk and powered milk by high performance liquid chromatography（HPLC）.The samples were extracted with acetonitrile.After cleaned up by the immunoaffinity column,the analytes were detected by HPLC-UV.The recoveries of six analogs were all in the range of 80%-110%,and the RSDs were less than 12%.

zeranol;analogs;HPLC;immunoaffinity column

TS252.7

A

1001-2230（2011）12-0034-02

2011-10-31

科技部科技型中小企业技术创新基金（11C26211103846），北京市科技专项（Z11110205511108）。

张清杰（1986-），女，硕士研究生，从事超微量分析化学和食品安全检测技术的研究。

聂长明