葛志华 杨 宁 孙立新

野黄芩苷对内毒素抑制人牙周膜细胞碱性磷酸酶活性的影响

葛志华 杨 宁 孙立新＊

(承德医学院附属医院河北 067000)

目的 观察野黄芩苷对内毒素 (LPS)抑制人牙周膜细胞的碱性磷酸酶活性的影响。方法 原代培养人牙周膜细胞,采用酶动力学方法观察野黄芩苷对L PS抑制人牙周-膜细胞碱性磷酸酶活性的影响。结果 100μg/mL L PS可显著抑制体外培养的人牙周膜细胞碱性磷酸酶活性。加入0.001-10μg/ml野黄芩苷干预后,对L PS抑制碱性磷酸酶活性有一定的拮抗作用,在1μg/ml时达到高峰。结论 野黄芩苷可能通过拮抗LPS抑制牙周膜细胞碱性磷酸酶的活性,促使牙周膜细胞向成骨细胞分化而利于牙周组织再生修复。

野黄芩苷; 人牙周膜细胞; 内毒素; 碱性磷酸酶

人牙周膜细胞 (human periodontal ligament cell,HPDLC)是牙周组织内具有多向分化潜能的群体细胞,在维护牙周组织的健康中起着重要作用。LPS作为牙周病的主要致病物质,可使 HPDLC丧失多向分化的潜能,影响牙周组织的再生修复。目前,如何促进牙周膜细胞向形成新牙槽骨、牙周膜和牙骨质的方向分化从而形成新的牙周组织已成为牙周病研究的热点之一。大量的研究报道,许多生物活性因子和中药在诱导牙周膜细胞分化、促进牙周组织修复的过程中都具有较好的作用。中药野黄芩苷是从黄芩茎叶中提取的一种新的黄酮类化合物,现代药理研究证实黄酮类化合物在抗炎、抗变态反应、抗微生物和抗肿瘤等多方面都有一定的作用[1]。本实验旨在观察野黄芩苷对L PS抑制HPDLC的ALP活性的影响,探讨其对牙周膜细胞向成骨方向转化的作用,为临床应用于再生修复牙周组织提供实验依据。

材料和方法

1.主要试剂和仪器

中药野黄芩苷 (中国生物药品检定所),E.coliL PS(Sigma公司),DMEM培养液 (Gibco公司),胎牛血清 (fetal bovine serum,FBS中美合资兰州民海生物工程有限公司),Ⅰ型胶原酶(Bejing Biotechnology),胰蛋白酶 (中国医学科学院血研所科技公司),青霉素、链霉素、两性霉素B(华北制药股份有限公司),SP免疫组化试剂盒、波形丝蛋白和角蛋白单抗 (北京中山生物技术公司),YT-CJ-1N型洁净工作台 (北京亚泰科隆实验科技开发中心),倒置相差显微镜及照相系统(Olympus,日本),CO2孵箱 (SANYO日本),BIO-RAD伯乐680型全自动酶标仪 (美国),AL P试剂盒 (南京建成生物工程研究所),Triton X-100(北京化学试剂公司)。

2.主要溶液配制

野黄芩苷溶液的配制:取2mg野黄芩苷溶于2ml PBS中,Na HCO3调p H值至7.4,至野黄芩苷完全溶解,成为1mg/ml的储存液,过滤除菌,用含2%FBS的DMEM培养基将其稀释成所需浓度。

L PS溶液配制:取10mg L PS,用含2%FBS的DMEM培养基将其稀释,振荡,使充分溶解,并将其配成200μg/ml浓度,过滤除菌,备用。

3.牙周膜细胞的来源、培养和鉴定

选取承德医学院附属医院口腔科就诊12-18岁青少年因正畸拔除的正常前磨牙,用含青霉素、链霉素、两性霉素B的DM EM培养液充分洗牙,用刀片刮取牙根中1/3的牙周膜组织,0.2%Ⅰ型胶原酶摇床振荡消化至大部分细胞游离、吹打、分散,加入少量含10%FBS的DMEM培养液,离心,弃上清液,将细胞和组织收集到培养皿中,置5%二氧化碳培养箱中培养。原代培养成功后,常规换液,待细胞长至80%后,用0.25%胰蛋白酶消化传代。取生长良好的第3代HPDLC接种于盖玻片上培养,待细胞长至70%时,取出盖玻片,常规固定,SP免疫组化法进行波形丝蛋白、角蛋白染色,光镜观察鉴定、摄影。

4.实验分组

分为3组:正常对照组,L PS组,野黄芩苷+L PS组,正常对照组DMEM培养液含2%FBS;LPS组DMEM培养液含2%FBS+LPS;野黄芩苷+L PS组的DM EM培养液含2%FBS+野黄芩苷+LPS,其中L PS的终末浓度为100μg/ml,野黄芩苷的终末浓度分别为 0.001、0.01、0.1、1、10μg/ml。

5.各实验组AL P活性的检测

取生长良好的第6代 HPDLC,调整细胞密度至3×104/ml,接种于24孔培养板,每孔接种细胞悬液1ml,标准环境下孵育24h后弃去培养液和未贴壁细胞,加入以上各组溶液1ml,标准环境下孵育3d后,每组取3孔作细胞计数。另外5孔用PBS洗 3遍,每孔加入 100μl 0.2%Triton X–100,置于4℃冰箱过夜。观察无完整细胞结构后,吹打混匀,取各孔液体50μl,按AL P试剂盒说明按比例依次加入缓冲液、基质液、显色剂,酶标仪上选择波长490nm,测各孔OD值,再根据每组细胞计数情况折算成1×105个细胞的OD值。

6.统计学方法

数据采用SPSS11.5统计学软件进行处理,组间比较采用单因素方差分析,两两比较用LSD检验,P<0.05表示有统计学意义。

结 果

1.形态学观察

原代培养细胞呈长梭形或星形,胞突细长,胞体丰满,胞质均匀,核圆形或卵圆形者为牙周膜细胞 (图 1)。

2.免疫组化鉴定

HPDLC经免疫组化波形丝蛋白染色阳性 (图2),细胞胞质棕黄色着色;角蛋白染色阴性 (图3),胞质不着色,说明细胞来源于中胚层。取免疫组化角蛋白阴性、波形丝蛋白阳性的5-10代细胞用于实验。

图1 倒置显微镜下 HPDLC形态 (×200);图2 波形丝蛋白染色阳性 (SP法×200);图3 角蛋白染色阴性 (SP法×200);Fig.1 HPDLCs in under phase-contrast microscope(×200);Fig.2 The positive expression of vimentin in plasma of HPDLCs(SP method×200);Fig.3 The negative expression of keratin in the plasma of HPDLCs(SP method×200)

3.ALP活性测定结果

从表1,图4可以看出,100μg/ml L PS可显著抑制ALP活性。加入不同浓度野黄芩苷后,对L PS抑制AL P活性有一定的拮抗作用,其中在0.1μg/ml时开始与LPS组有显著性差异 (P<0.05),1μg/ml时达到高峰,与L PS组比较有极显著性差异 (P<0.01)。

表1 各实验组AL P活性的检测结果Table 1 The ALP activity in each group

图4 各实验组ALP活性的检测结果图Fig.4 The ALPactivity in each group

讨 论

碱性磷酸酶 (ALP)作为一种成骨细胞的标志性酶,是成骨代谢敏感而特异的指标。研究表明,ALP在牙周组织有较强活性,并参与骨骼的钙化、组织代谢和再生。人牙周膜细胞是一种具有多种生物学功能和分化潜能的细胞群,是牙周组织进行再生修复的关键细胞。既往研究发现,HPDLC具有合成和分泌大量胶原和非胶原蛋白,表达较高AL P活性等生物学特征[2]。因此AL P活性高低可作为牙周膜细胞的骨化指标之一,反映牙周膜细胞向成骨方向转化的趋势[3]。

LPS作为革兰氏阴性菌中所独有的一种致病物质,对牙周组织细胞具有很强的毒性和抗原作用,被认为是牙周炎症的重要病因之一,在牙周病的发展过程中起着重要作用。L PS作为牙周病的主要致病因子,对 HPDLC细胞毒作用主要表现为:降低HPDLC的AL P活性,使其丧失向成骨样细胞和成牙骨质样细胞分化的潜能;抑制细胞的增殖;降低细胞的附着和定向移动能力等[4,5]。我们的结果表明,加入100μg/ml LPS时,能明显抑制HPDLC的ALP活性,此结果与其他学者研究结果一致[5],提示LPS可抑制 HPDLC成骨细胞样特征,诱导 HPDLC表型改变,使牙周膜不能进行正常更新和改建,从而影响牙周组织的再生修复功能。目前,中药对牙周组织再生修复的研究已越来越受关注。有研究报道[6,7],中药如五倍子、黄芩、黄连、骨碎补等可提高 HPDLC的AL P活性,有促使人牙周膜细胞向成骨方向转化的作用。本实验研究的野黄芩苷是从黄芩茎叶中提取的一种新的黄酮类化合物。已有研究证实[8],黄芩对常见牙周细菌有明显的抑制作用,窦永青等[9]也发现,从黄芩根中提取的黄芩苷有降解LPS的作用,并且这种作用具有浓度时间依赖性。本实验结果显示,加入不同浓度的野黄芩苷对L PS抑制ALP活性有拮抗作用,该作用在野黄芩苷较低浓度0.001μg/ml、0.01μg/ml时不明显,在 0.1μg/ml时开始显效,并且在浓度为1μg/ml时,作用达到最强。从而提示适当浓度野黄芩苷在病变修复过程中,阻断L PS抑制AL P活性,促使 HPDLC向成骨细胞转化,从而发挥修复牙周组织的作用。但野黄芩苷是否具有直接增强ALP活性,诱导 HPDLC分化促进牙周组织再生修复的功能,还需要进一步的研究。

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EFFECTSOF SCUTELLARINON THE AL KALINE PHOSPHATASE ACTIVITY OF HUMAN PERIODONTAL LIGAMENT CELLS INHIBITED BY LPS

Ge Zhihua,Yang Ning,Sun Lixin＊
(A f f iliated Hospital of Chengde Medical College;Hebei 067000,China)

Objective To investigate the effects of scutellarin on the alkaline p hosphatase activity of the human periodontal ligament cells inhibited by L PS.Methods Human periodontal ligament cells(HPDLCs)were primarily cultured in vitro.Enzyme dynamic methods were applied to observe the alkaline phosphatase activity of the human periodontal ligament cells.Results The alkaline phosphatase activity was remarkably inhibited by incubation of HPDLCs with 100μg/ml L PSof E.Coli and was improved in the presence of different concentrations of scutellarin f rom 0.001 to 10μg/ml,with the optimal effect at 1μg/mL of scutellarin.Conclusion Scutellarin may have the ability of promoting human periodontal ligament cells to transform into bone cells by blocking the inhibiting effects of LPSon the alkaline phosphatase activity of human periodontal ligament cells treated with LPS.

Scutellarin; Human periodontal ligament cell(HPDLC); LPS; Alkaline phosphatase

781.4

A

10.3870/zgzzhx.2010.04.011

2009-12-15

2010-04-27

河北省中医药管理局2006计划课题 (2006037)

葛志华,女 (1956年),汉族,教授,医学博士。

＊通讯作者(To whom correspondence should be addressed)