康新 刘国辉 路小光 范治伟 白黎智 刘莉 庞洪刚 康利民 纪春阳

·短篇论著·

Toll样受体4/NF-κB信号转导通路在重症急性胰腺炎肺损伤中的表达及血必净的干预作用

康新 刘国辉 路小光 范治伟 白黎智 刘莉 庞洪刚 康利民 纪春阳

急性肺损伤(acute lung injury，ALI)和急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是重症急性胰腺炎(SAP)最常见的早期并发症，发生率高达33%，发病1周内病死的SAP患者中60%～80%与ALI/ARDS有关[1-2]。Toll样受体(TLR)家族成员在识别病原体并介导天然免疫反应中具有重要作用，其信号转导通路主要包括NF-κB、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)和应激活化蛋白激酶信号转导通路[3-4]。本实验应用血必净干预急性坏死性胰腺炎(ANP)并发ALI的大鼠，观察其对信号转导通路中Toll样受体4(TLR4)、NF-κB表达的影响，探讨血必净的作用机制，为临床应用提供理论依据。

一、材料与方法

1．实验动物及分组：健康清洁级SD大鼠96只，体重(220±20)g，雌雄不拘，购自大连医科大学实验动物中心。适应性喂养1周后抽签法随机分为假手术组、ANP并发ALI(ANP-ALI)组和血必净组，每组32只。采用胰胆管逆行缓慢注射4%牛磺胆酸钠(美国Sigma公司)1 ml/kg体重方法制备ANP-ALI模型。同时选取空肠起始部以下约2 cm处置入造瘘管经由皮下引出体外，妥善固定。假手术组触摸胰腺数次及空肠造瘘后关腹。血必净组于制模后0.5 h经瘘管注入血必净(天津红日药业有限公司赠送)2 ml；假手术组和ANP-ALI组注入等容积生理盐水。术后3、6、12、24 h分批处死大鼠8只，取血及胰腺、肺组织。

2．血清淀粉酶、Ca2+、PaO2、PaCO2、内毒素、TNF-α、IL-1β含量测定：用全自动生化仪(57600-010，日本日立公司)测定血清淀粉酶、Ca2+含量。Bayer血气分析仪测定血PaO2、PaCO2。应用内毒素检测试剂盒(天津一瑞生物工程有限公司)在MB-80微生物快速动态检测系统中检测血清内毒素含量，按说明书操作，由标准曲线自动计算出待测血清内毒素含量。采用ELISA法检查血清TNF-α、IL-1β含量，试剂盒购自Sigma公司,按说明书操作。

3．肺组织病理学检查、肺损伤评分以及湿/干重比测定：取右肺上、中叶，常规病理检查，采用Osman等[5]的标准对肺损伤评分。取左肺称重，置80℃电热干燥箱内烤72 h ，再称干重，按[(肺湿重-肺干重)/ 肺干重]×100%计算肺组织湿/干重比(W/D)。

4．肺组织TLR4、NF-κB蛋白表达检测：取100 g右下肺组织，电动匀浆机匀浆， BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。常规行Western blotting。抗TLR4、NF-κB一抗及辣根过氧化物酶标记的二抗购自美国Santa cruz公司，ECL发光剂显影后硝酸纤维素膜在FluorSMutilmager图像分析仪上用QuantityOne4.1图像分析软件进行分析，以相应蛋白条带面积的平均灰度值表示TLR4、NF-κB p65活化水平的相对含量。

二、结果

1．血清淀粉酶、Ca2+、PaO2、PaCO2、内毒素、TNF-α、IL-1β含量的变化：ANP-ALI组术后血清淀粉酶、内毒素、TNF-α、IL-1β含量及PaCO2较假手术组均显著升高(P<0.05或P<0.01)，而血必净组较ANP-ALI组显著降低(P<0.05或P<0.01)。ANP-ALI组术后血Ca2+、PaO2均较假手术组显著降低(P<0.01)，而血必净组较ANP-ALI组显著升高(P<0.05，表1)。

2．肺组织病理学改变和湿/干重比：ANP-ALI组术后3 h肺组织轻度水肿，镜下见间质水肿、充血、少量单核细胞及中性粒细胞浸润；6、12 h病变加重；术后24 h肺呈暗红色，出现片状出血及淤血改变，切面有大量暗红色血性液体渗出，镜下见肺泡和间质重度水肿、出血，肺泡间隔增宽，大量炎细胞浸润，组织结构紊乱。血必净组各时间点肺组织的损伤均较ANP-ALI组明显减轻(图1)。ANP-ALI组的肺损伤评分及湿/干重比均较假手术组显著增加，而血必净组较ANP-ALI组显著降低(P<0.05或P<0.01，表2)。

3．肺组织TLR4、NF-κB p65表达变化： ANP-ALI组TLR4和NF-κB p65表达较假手术组显著升高(P<0.05或P<0.01)，而血必净组较ANP-ALI组显著降低(P<0.05，图2，表2)。

表1 各组血清淀粉酶、Ca2+、PaO2、PaCO2及血清内毒素、TNF-α、IL-1β含量

注：与假手术组比较，aP<0.05，bP<0.01；与ANP-ALI组比较，cP<0.05，dP<0.01；1 mmHg=0.133 kPa

表2 肺损伤评分、肺湿/干重比及TLR4、NF-κB p65表达变化

注：与假手术组比较，aP<0.05，bP<0.01；与ANP-ALI组比较，cP<0.05，dP<0.01

图1假手术组(a)、ANP-ALI组(b)和血必净组(c)术后3(上)、24 h(下)的肺组织病理改变(HE ×200)

图2 不同时间点各组肺组织TLR4与NF-κB的表达

讨论研究发现，SAP常伴发肠源性内毒素(LPS)血症，在推动ANP-ALI病程发展中起重要作用[6-7]。Toll受体家族既是LPS的信号分子，也是LPS的受体。分布在单核巨噬细胞表面的TLR4对LPS炎症信号向胞内传导起主要作用，是LPS的优先受体[8]。NF-κB是广泛存在于细胞中具有多种转录调节作用的核转录因子，它能参与多种炎症细胞因子过度表达，参与多种疾病过程。NF-κB与基因启动子和(或)增强子中特定的κ序列结合，启动和调控众多参与炎症过程细胞因子和炎症介质的基因表达。近年研究表明，TLR与其配体相结合后激活NF-κB移入核内，进一步使TNF-α、IL-1β、 IL-6、 IL-8等炎症介质的基因转录增强[9-10]。本结果显示，ANP-ALI组大鼠血淀粉酶、PaCO2、内毒素及肺组织学评分、TNF-α、IL-1β水平均较假手术组增高，肺组织

TLR4和NF-κB表达也同步增加，说明ANP大鼠肺组织TLR4和NF-κB也参与了ALI的发病过程。

中药血必净注射液的主要有效成分包括红花、黄色素A、川芎嗪、丹参素、阿魏酸、芍药苷、原儿茶醛等。血必净干预后血清淀粉酶、内毒素水平、肺损伤评分、肺湿/干重比均较ANP-ALI组明显降低；肺组织TLR4、NF-κB表达也较ANP-ALI组明显下降，其下游的TNF-α、IL-1β促炎症因子表达也降低。因此推测血必净可能在ANP-ALI病程早期抑制肠道内细菌易位，减少了肠源性内毒素的产生，降低了内毒素对TLR4的刺激能力，随后通过抑制NF-κB p65活化，下调TNF-α、IL-1β等促炎细胞因子的释放，从而减轻肺组织损伤，阻止SAP的病程进展。

[1] Wig JD,Bharathy KG,Kochhar R,et al.Correlates of organ failure in severe acute pancreatitis.JOP, 2009,10:271-275.

[2] Shaheen MA,Akhtar AJ.Organ failure associated with acute pancreatitis in African-American and Hispanic patients.J Nat Med Assoc,2007,99:1402-1406.

[3] Takagi Y,Masamune A,Kume K,et al.Microsatellite polymorphism in intron 2 of human Toll-like receptor 2 gene is associated with susceptibility to acute pancreatitis in Japan.Hum Immunol,2009,70:200-204.

[4] Sharif R,Dawra R,Wasiluk K,et al.Impact of toll-like receptor 4 on the severity of acute pancreatitis and pancreatitis-associated lung injury in mice.Gut,2009,58:813-819.

[5] Osman MO，Jacobsen NO，Kristensen JU,et al．A monoclonal anti-interleukin 8 antibody(WS-4) inhibits cytokine response and acute lung injury in experimental severe actue necrotising pancreatitis in rabbits．Gut，1998，43:232-239．

[6] Matsuda N,Nishihira J,Takahashi Y,et al.Role of macrophage migration inhibitory factor in acute lung injury in mice with acute pancreatitis complicated by endotoxemia.Am J Respir Cell Mol Biol,2006,35:198-205.

[7] Inoue K,Takano H,Yanagisawa R,et al.Protective effects of urinary trypsin inhibitor on systemic inflammatory response induced by lipopolysaccharide.J Clin Biochem Nutr,2008,43:139-142.

[8] Vabulas RM，Ahmad-Nejad P，da Costa C，et al．Endocytosed HSP60s use Toll-like receptor 2 and TLP4 to activate the Toll/interleukin-1 receptor signaling pathway in innate immune cells．J Biol Chem，2001，276：31332-31339．

[9] Musikacharoen T，Matsuguchi T，Kikuchi T，et al．NF-kB and STAT5 play important roles in the regulation of mouse Toll-like receptor 2 gene expression．J Immunol，2001，166：4516-4524．

[10] Pandey S，Agrawal DK．Immunobiology of Toll-like receptors:Emerging trends.Immunol Cell Biol,2006,84A:333-341．

2010-02-22)

(本文编辑：吕芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.06.019

116001 大连，大连大学附属中山医院急诊外科(康新、路小光、范治伟、白黎智、刘莉、庞洪刚、康利民、纪春阳) ；吉林大学附属第一医院急诊科 (刘国辉)

路小光，Email：kangxinhao1@yahoo.com.cn