吴 达,师彦平,张彦明

(1.西北农林科技大学动物医学院,陕西杨凌712100;2.中国科学院兰州化学物理研究所,甘肃兰州730000;3.甘肃出入境检验检疫局,甘肃兰州730020)

甘肃棘豆(Oxytropis Kansuensis Bunge)是豆科棘豆属植物,其研究已历经百年,在积极探讨其防除和综合利用的同时,大量研究结果表明,其生物碱部位具有明显的抗肿瘤活性[1-3]。本试验以荷H 22肝癌肿瘤小鼠为模型,进一步研究证实其抗肿瘤活性;并在细胞学水平观察甘肃棘豆生物碱阻止H 22细胞恶性表型及直接杀伤肿瘤细胞的作用,在分子生物学水平观察与恶性肿瘤发生发展过程密切相关的增殖细胞核抗原(PCNA)、突变型p53蛋白表达及生物碱的干预作用,为研究甘肃棘豆生物碱抑制肿瘤活性机理提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 动物及瘤株 动物选用昆明系小鼠,6～8周龄,体重(20±2.0)g,雄性,由甘肃省医学科学研究院实验动物中心提供,合格证号：医动字第14-009号;试验环境：温度20℃～22℃,相对湿度45%～50%,环境设施合格证：医动字第14-019号;H 22瘤株购于中国医学科学院药物研究所。按常规方法,无菌条件下,选择生长良好的H 22,制备成细胞悬液,调整细胞浓度为1.46×106/mL,于小鼠右前腋下接种0.2 mL/只。接种次日,随机将接种好的小鼠分成3组,每组为10只。抑瘤试验重复2次。

1.2 药物 甘肃棘豆生物碱,于中国科学院兰州化学物理研究所西北天然药物研发中心提取,参照预试验及活性筛选给药量,配制生物碱试验用剂量为0.25 g/kg,蒸馏水阴性对照组和生物碱试验组灌胃(ig)给予,接种24 h后开始给药,给药量0.2 mL/10 g体重;环磷酰胺(CTX)：中美合资山西泰盛制药有限公司生产,批号011121,临时用注射用水配成所需浓度(25 mg/kg),腹腔注射(ip)给药,每日0.1 mL/10 g体重,给药10 d。

1.3 试验用品和试验方法 所有动物每天给药1次,连续10 d。并隔日称体重1次。停药次日脱颈处死小鼠,剖取瘤块,称瘤重及体重,计算抑瘤率。

肿瘤抑制率(%)=(1-给药组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100%

剖取瘤块,4℃酸性福尔马林保存,常规石蜡包埋,切片后行病理检查(H.E.染色)及PCNA、p53蛋白检测(免疫组化SP法)。鼠抗PCNA及p53单克隆抗体均购自福州迈新生物技术有限公司。免疫组化SP法,具体操作按说明书进行。

1.4 统计方法 用SPSS软件包作方差分析。

2 结果

2.1 肿瘤肉眼观察及抑瘤率 蒸馏水对照组瘤块相对给药组和环磷酰胺组较大,肿瘤有液化并和胸膜甚至肋骨粘连,肿瘤血管丰富,不易剥离,呈扩散生长趋势;生物碱和环磷酰胺组瘤块较小,肿瘤坚实,颜色苍白,易于剥离。生物碱给药组抑瘤率分别为51.89%、39.84%和46.02%,环磷酰胺阳性对照组抑瘤率分别为66.04%、70.31%和75.22%,试验结果重复性较好,各组与对照组比较差异极显著(P＜0.001),见表1。

2.2 病理检查 蒸馏水阴性对照组小鼠肿瘤切片高倍镜观察：肿瘤细胞呈团簇状密集生长,排列坚实,核较大浓染,形态各异,异型性明显,生物碱给药组和环磷酰胺组可见大面积红染无结构的坏死区,肿瘤细胞明显减少,残存肿瘤细胞大多萎缩,核深染固缩或碎裂迫向死亡,也可见个别逆转肿瘤细胞,核明显缩小,周围胞浆红染,核浆比例减小,呈规则的圆形或椭圆形。组织间有炎性细胞浸润。见中插彩版图1。

2.3 PCNA表达 PCNA阳性即细胞核染成棕褐色为阳性反应,结果采用PCNA阳性细胞数衡量。随机观察10个高倍镜视野,计算每个高倍镜视野100个肿瘤细胞中的阳性细胞数,取其平均值作为统计用结果。结果表明,生物碱给药组和环磷酰胺阳性对照组PCNA阳性表达均较阴性对照减少(见中插彩版图2)。各组PCNA表达的阳性细胞数见表2,统计学处理差异极显著(P＜0.001)。

表1 生物碱对小鼠H22肿瘤作用结果

表2 小鼠H22肿瘤细胞PCNA表达

2.4 p53蛋白表达 将所制切片在光学显微镜高倍镜下观察,以细胞核呈现明显的棕褐色颗粒状染色为阳性细胞,细胞核蓝染的细胞为苏木素复染的阴性细胞。免疫组化SP法结果表明,环磷酰胺阳性对照组和甘肃棘豆生物碱组p53阳性细胞数均不同程度低于阴性对照组(P＜0.05),见中插彩版图3。各组小鼠H 22肿瘤p53表达的阳性细胞数见表3。

表3 小鼠H22肿瘤细胞p53的表达

3 讨论

3.1 甘肃棘豆生物碱对小鼠H22肿瘤的抑制作用恶性肿瘤是机体局部组织细胞在各种内部和外界的致癌因子长期作用下,逐渐发生持续性异常增生所形成的新的生长物或新生物,它是由正常细胞获得了新的生物遗传特性转化而来,具有自主性、去分化性和可移植性。恶性肿瘤常导致局部正常组织结构破坏,组织恶性表型,包括细胞异型、细胞核增大、核分裂相、核浆比例增大等[4]。本试验采用H22肿瘤模型,经病理切片检查,蒸馏水阴性对照组符合癌变特征,但在给予甘肃棘豆生物碱后,情况有所不同,出现大量肿瘤细胞坏死和恶性表型逆转,表明其对小鼠H 22肿瘤具有明显的抑制作用。

3.2 PCNA表达及甘肃棘豆生物碱干预意义PCNA是存在于细胞核内的一种蛋白质,即DNA聚合酶δ的辅助蛋白,与DNA的复制密切相关,它对细胞由G1期向S期过度起着重要的调节作用,与肿瘤细胞的增殖密切相关[5-6]。本试验蒸馏水阴性对照组肿瘤细胞中的PCNA呈高表达,肿瘤细胞增殖旺盛,而生物碱给药组PCNA表达降低,说明甘肃棘豆生物碱可抑制H 22肿瘤细胞增殖。

3.3 p53蛋白表达及生物碱干预意义 p53是53kD的核内磷酸蛋白。p53基因突变时,p53蛋白构象发生变化,从而产生积聚并显示出表达增强,突变型p53在体内有较长的半衰期,免疫组化法可检测到阳性表达。突变型p53不但丧失抑瘤活性,并可能在DNA复制水平上调节细胞生长,是促进肿瘤发生、发展及导致增殖异常活跃的一个重要因素[7-9]。本试验中,阴性对照组p53蛋白呈现高表达,生物碱给药组和环磷酰胺组肿瘤组织p53蛋白呈现较低表达,说明它们能较好防止肿瘤细胞中的p53蛋白成为被激活的突变型p53癌基因,从而减缓肿瘤的生长和恶变。

此外,许多研究认为,在组织恶变过程中p53蛋白与PCNA之间存在着密切的正相关[10-11],作为核内转入因子的突变型p53基因由于激活了某些细胞增殖相关基因的表达功能,促进细胞增殖,从而使PCNA呈现高表达。本研究在观察p53蛋白表达的同时也观察了PCNA的表达,同样观察到两者之间密切而同步的关系。一方面,PCNA与细胞增殖相关,恶性肿瘤重要的生物学特征之一就在于组织细胞自主性增殖、生长;而另一方面,p53基因的突变又与组织细胞恶变有关,因此,在突变型p53基因蛋白表达与PCNA表达的两者之间存在着前后因果的关系。

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