王庆华,乔志军,金艺鹏,裴增杨,林德贵

(1.中国农业大学动物医学院,北京 海淀 100193;2.拜耳(四川)动物保健有限公司,北京 朝阳 100020)

盐酸特比萘芬是一种广谱抗真菌药物[1-4],临床上广泛用于治疗浅部真菌病,结果显示盐酸特比萘芬治疗浅部真菌病疗程短、疗效高、不良反应少[5-6]。对由皮肤癣菌引起的甲真菌病特比萘芬比灰黄霉素、伊曲康唑和氟康唑疗效要好[7-8]。近年来,盐酸特比萘芬也逐渐应用于兽医临床,以治疗小动物真菌病[9-10]。

盐酸特比萘芬口服后吸收良好,约70%～80%被吸收;血浆蛋白结合率高达99%,并具有亲脂性和亲角质性,能迅速经真皮层弥散并集中在角质层。该药主要在肝脏代谢,代谢产物无抗菌活性,主要经过肾脏排泄,口服吸收量的80%以代谢物形式由尿液排出,少部分经过胆汁、粪便排泄。该药消除半衰期为17 h,在体内无蓄积作用,其稳态血药浓度不受年龄影响。但肝、肾功能不全者对特比萘芬的清除率可能降低,从而导致血药浓度升高,出现肝、肾损伤。在兽医临床上研究特比萘芬对犬猫肝、肾损伤的资料较少。并且特比萘芬致肝、肾功能正常者肝脏及肾脏损伤的机制目前尚不完全清楚,可能由于药物的直接毒性,也可能通过独特的免疫学和代谢机制导致机体特发性反应。本试验采用组织病理学方法检测口服不同剂量的盐酸特比萘芬后猫肝脏和肾脏器官的组织学变化,以探讨盐酸特比萘芬对猫肝肾的损伤影响,为兽医临床合理应用盐酸特比萘芬治疗犬猫真菌病提供临床用药的试验数据及相关病理资料。

1 材料

1.1 实验动物 28只短毛猫 ,公猫15只和母猫13只,2.5～4岁,平均体重2.8 kg,来自中国农业大学实验动物中心。实验动物适应饲养环境3周后,对实验猫进行全面体况检查及实验室检验。健康猫入选本研究。在试验前6周内局部使用或系统性使用过药物的猫不入选。

1.2 试验药物及配置 盐酸特比萘芬片剂：北京诺华制药公司;规格：每片250 mg。配置方法：将片剂药物研磨,根据实验动物体重准确称取相应重量药物。

1.3 主要仪器 山东医疗器械厂 LX-75型切片机,英国Shandon半自动石蜡包埋机,英国Shandon自动烤片机,重庆光学仪器厂COIC XSZ-G型光学显微镜。

1.4 其他主要材料 优级纯甲醛、二甲苯、中性树胶、苏木精-伊红染色液、明胶、石蜡等均由中国农业大学动物医学院临床系外科实验室提供。

2 方法

2.1 实验动物的饲养 饲喂伟嘉成年猫粮,自由饮水。

2.2 实验动物分组及给药步骤 3周适应期后,28只猫被随机分为4组(7只/组)。盐酸特比萘芬以兽医临床推荐使用剂量10 mg/kg◦d为基础,适当的加量作为试验剂量,即分为低剂量组(10 mg/kg◦d)、中剂量组(20 mg/kg◦d)、高剂量组(40 mg/kg◦d)和对照组(0 mg/kg◦d)。不同组的实验猫连续3周口服给药相应剂量的盐酸特比萘芬。

2.3 组织采集及保存方法 分别在给药后第3周(即第21天)和第5周(即第35天)取不同剂量组的实验猫各3只,安乐死后分别取肝脏及肾脏部分组织,分成大小约1 cm3的小组织块,使用10%中性福尔马林固定备用。

2.4 肝、肾病理组织学切片的制作 按常规组织学切片制作方法制作肝、肾组织学切片。

2.5 切片观察 用显微镜对肝肾病理组织切片进行观察和拍照。

3 结果与分析

3.1 口服不同剂量盐酸特比萘芬的猫肝脏组织病理切片观察 本试验中通过H.E染色进行病理学观察可见,口服不同剂量的盐酸特比萘芬均能造成不同程度的猫肝实质病变。染色并镜检表现为：肝索紊乱、肝窦不明显、界限不清晰,以及不同程度的间质水肿;肝细胞空泡变性,肝细胞显著肿胀,核固缩;肝细胞胞浆内有少量棕红色含铁血红素颗粒沉着,疑为肝性胆红素阻塞;汇管区与小叶间界限不清晰,小叶间结缔组织增生,形成胶原纤维;肝中央静脉扩张,小叶间静脉极度扩张;血管内有大量含铁血红素沉着;不同程度的胆管增生、纤维化;不同程度的嗜中性粒细胞、淋巴细胞浸润,炎性细胞多分布于肝小叶及汇管区。高剂量特比萘芬能导致门管区更严重的炎性反应,大量的淋巴细胞形成淋巴滤泡;小叶间结缔组织增生更为明显;肝细胞严重肿胀、核固缩明显。见中插彩版图 1、图2。

3.2 口服不同剂量盐酸特比萘芬的猫肾脏组织病理切片观察 H.E.染色进行病理学观察可见,口服不同剂量的盐酸特比萘芬均能造成不同程度的猫肾实质病变。主要表现为肾间质充血扩张,髓质血管轻度扩张、充血;广泛性的肾小管上皮空泡变性,胞碎裂、坏死;肾小管上皮细胞明显核固缩;散在肾小管上皮细胞溶解;管腔内存在少量散在性管型;近曲小管管腔内有蛋白颗粒,细胞肿胀,管腔变窄;远曲小管管腔扩张,集合管扩张,并有少量纤维组织增生;被膜下肾小管变性坏死,间质中有局灶性淋巴细胞浸润;肾小球内皮与基底膜细胞分离。

对不同剂量的给药组实验猫肾脏损伤进行比较发现,高剂量特比萘芬能导致肾小管上皮严重的空泡变性,部分核溶解甚至消失;皮质肾小管上皮严重肿胀,明显核固缩;肾小管封闭,肾小球基底膜增厚;甚至造成肾小球萎缩,肾小囊出血。见中插彩版图3、图4。

3.3 口服盐酸特比萘芬在不同时期对猫肝脏组织病理切片观察 饲喂各剂量组特比萘芬的试验猫在持续给药3周后停止给药,继续观察实验猫的各种指标。在停药两周后(即试验的第35天),分别取肝脏与肾脏组织行组织病理学切片。H.E.染色后进行病理学观察发现,口服盐酸特比萘芬3周后停药两周明显比口服盐酸特比萘芬21 d对猫肝脏造成的组织病理学损伤严重。结果显示：试验第5周肝细胞变性情况比试验第3周更严重,肝细胞肿胀显著、空泡变性;小叶间结缔组织增生严重;门管区炎性细胞尤其是嗜中性粒细胞及淋巴细胞浸润增多。见中插彩版图5。

3.4 口服盐酸特比萘芬在不同时期对猫肾脏组织病理切片观察 H.E.染色后进行病理学观察发现,口服盐酸特比萘芬3周后停药2周明显比口服盐酸特比萘芬21 d对猫肾脏造成的组织病理学损伤严重。具体的显微对比结果为肾小管上皮空泡变性更为严重,核固缩更明显;肾小管管腔内有更多量的蛋白颗粒;间质中更多量的纤维组织增生;间质中有更多的炎性细胞,尤其是淋巴细胞呈片状浸润。见中插彩版图6。

组织学切片观察结果表明,对照组猫的肝脏和肾脏未见病理学变化。

4 结语

本试验采用组织病理学方法观察了口服盐酸特比萘芬的正常猫肝肾组织学变化,以探讨盐酸特比萘芬对猫肝肾的损伤。从组织病理学检查可以得出：(1)口服不同剂量的盐酸特比萘芬均能造成不同程度的猫肝肾实质病变;盐酸特比萘芬对猫肝肾的损伤具有明显的量效关系：高剂量组与低、中剂量组相比具有更显著的肝肾损伤效应。(2)口服盐酸特比萘芬3周后停药2周(即给药后第35天)明显比口服盐酸特比萘芬给药后第21天对猫肝肾造成的组织病理学损伤严重,提示了盐酸特比萘芬对猫肝肾的损伤可能是一个药物蓄积的损伤过程。

本试验证实了口服盐酸特比萘芬对猫肝肾的损伤作用,提示兽医临床上应用盐酸特比萘芬治疗猫皮肤真菌病时,应综合考虑该药的肝肾毒性,制定合理的用药剂量和用药周期。

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