易先国,李 卫,吴海港,雷咸波,梁存军,刘汉儒

(1.信阳农业高等专科学校动物科学系,河南信阳464000;2.信阳市光山县动物卫生监督所,河南信阳464000;3.河北省清河县农业局,河北清河054800;4.西南大学药学院,重庆北碚400700)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是一种病因及发病机理未明确的慢性肠道炎症性疾病,是炎症性肠病(inflammatory bowl disease IBD)的一种。哪种致病菌是这类肠黏膜炎症的致病原迄今缺乏相关研究。

本病主要以大肠黏膜以及黏膜下层发生慢性、非特异性炎症性病变为中心,黏膜上皮及腺体破坏、增生或萎缩,淋巴细胞、嗜中性粒细胞和单核细胞浸润.隐窝脓肿形成,因而呈现黏膜充血、糜烂、溃疡以及增殖性改变[1-2]。动物以犬多发,1965年由Van Kruiningen H[3]首先描述。拳狮幼犬特别易感;德国牧羊犬、爱尔兰塞特犬和阿富汗犬也常发。病犬易疲劳,喜睡,体重减轻,皮毛干燥。这种疾病在美国、澳大利亚、日本、瑞典、荷兰、英国都有报道,国内缺乏相关报道。

香连滴丸是由黄连、木香组成,根据中兽医理论具有清热燥湿,行气止痛之功效,对治疗溃疡性结肠炎具有理论依据。本试验参照Okayasu I[4]采用葡聚糖硫酸钠(DSS)自由饮水诱导小鼠产生UC模型,观察香连滴丸对化学试剂诱导的小鼠UC的治疗作用,为今后进一步研究提供依据。

1 材料

1.1 实验动物 健康雄性BALB/c小鼠40只,体重19～21 g,由重庆医科大学实验动物中心提供。

1.2 主要药品与仪器 香连滴丸(西南大学药学院自制,批号：20081126),葡聚糖硫酸钠(DSS)(美国Sigma公司),SOD、MDA试剂盒(南京建成生物工程研究所),隐血试剂盒(北京科泰生物工程有限公司),联苯胺(成都科龙化工厂)。低温自动平衡离心机(湖南衡阳仪器制造厂)。

1.3 溶液的配制 联苯胺试液的配制：称取适量的联苯胺,加入冰醋酸,配成1%溶液,装入棕色玻璃瓶中,避光保存;联苯胺试液与3%H 2O2滴入量之比为1∶1。4%DSS水溶液的配制：称取40 gDSS溶解于双蒸水,并定容到1 000 mL。

2 方法

2.1 试验分组及造模 将BALB/c小鼠40只,随机分成5组,每组 8只,分为正常组(A),模型组(B)、高剂量组 6 mg/kg(C)、中剂量组4 mg/kg(D)、低剂量组2 mg/kg(E),除正常组外均参照文献采用DSS模型法对小鼠进行造模。小鼠适应性饲养2 d后,禁食12 h,开始试验。用3%DSS(分子量500 000)溶液给小鼠自由饮水,连续7 d。造模期间每天观察小鼠性状、饮食、毛发、活泼状态等。模型建立成功的标志为饮用3%DSS后出现半稀便、腹泻、大便隐血(+)或肉眼血便中的任一症状。选取造模成功的小鼠随机分入各组。模型制作成功后,即造模第8天开始灌胃C、D、E组。

2.2 给药方法 参照Okayasu I[4]介绍的方法,对DSS的浓度进行适当的调整：小鼠自由饮用 4%DSS水溶液,连续7 d。在这期间,每天定时称量小鼠体重,进行隐血试验和观察粪便性状。

对模型组自然死亡的或第8天颈椎脱臼处死小鼠,剪开腹腔,清理出结肠,沿肠系膜剖开,剪下结肠(直肠至升结肠),冰冷生理盐水反复冲洗干净,用清洁滤纸吸干水分。

3 观察指标与结果

3.1 对小鼠一般情况的影响 试验后第3～4天,造模小鼠出现腹泻、饮食减少,体毛不光泽,第5～7天出现不同程度的肉眼血便,蜷缩,活动减少,体重减轻。经中药治疗1周,C、D、E组小鼠症状有不同程度改变,表现为食量增加,体重和毛泽渐渐恢复,肉眼血便减少,其中C、D组无肉眼血便,可见松散大便。而正常对照组小鼠一般性状无明显改观。

分别在实验第7、14天,将小鼠称重,并放入代谢笼中,收集小鼠大便,记录大便性状,并取部分粪便,测定隐血。以Murthy S N等[5]稍加改良评价疾病活动度(DAI),评分标准按表 1进行评分。DAI=(体重下降分数+大便性状分数+分数)/3,结果用H检验进行统计。

试验结果显示,模型组DAI分数最高,与香连滴丸高浓度组(C)、中浓度组(B)、低浓度组(E)比较有显著性差异(P＜0.01),如图1所示香连滴丸高浓度组DAI评分与中浓度组、低浓度组比较,有降低的趋势,但无统计学意义(P＞0.05)。

表1 疾病活动度评分

图1 香连滴丸对造模小鼠疾病活动度的影响

3.2 生化指标SOD及MDA的测定 结肠组织样品制备：取结肠组织块在冰冷生理盐水中漂洗干净,滤纸试干,准确称重后,立即用眼科剪剪碎组织块,置于冰浴的玻璃匀浆器中,加入生理盐水后匀浆,按重量体积比为1∶9加匀浆介质制备成10%组织匀浆。然后将匀浆液用高速低温离心机3 000 r/min离心15 min,取适量上清液进行测定。

香连滴丸不同剂量组对4%DSS诱导小鼠结肠组织SOD、MDA活性影响,如表2所示,与正常组比较,DSS模型组小鼠结肠组织SOD活性明显下降(P＜0.01);香连滴丸高剂量组和中剂量组能有效阻遏SOD活性降低和低剂量作用无明显差异。

DSS诱导模型组小鼠结肠黏膜组织中MDA含量显著增多,提示DSS致小鼠结肠黏膜氧化损伤。香连滴丸各个剂量组均能减少MDA的产生。

表2 香连滴丸不同剂量组对4%DSS诱导小鼠结肠组织SOD和MDA活性影响

4 讨论

UC是一种主要累及直肠、乙状结肠黏膜,甚至全结肠和回肠末端黏膜的非特异性炎症性疾患之一[6],DSS诱导的UC是一个重要模型,DSS破坏肠黏膜屏障,使黏膜组织凝固坏死,增加DSS的通透性,促进DSS在结肠中扩散,加重炎症反应[7]。该模型有操作简单、重现性好、造型时间短等特点。因此,比较适合该类药物的研究与筛选。

UC属中医的“泄泻”“久痢”“便血”等范畴,UC病机演变过程主要有三个典型时期,随病程延长,其证型的演变规律,为湿热蕴积大肠(湿热型);慢性间歇发作期为脾虚湿热并存(虚实夹杂);慢性持续严重期为脾肾气血俱亏。根据中兽医理论,香连滴丸方中黄连清热燥湿,治热痢,具有免疫调节作用;行气止痛,木香具有和胃消胀,止泻。调节胃肠运动,抗消化性溃疡,促进胆囊收缩的作用,通过长期健脾补肾,可以影响神经内分泌网络,调节激素神经递质细胞因子的变化与基因表达,从而影响活性物质的释放,改善机体免疫失衡状态。

试验结果表明,香连滴丸可明显降低小鼠DAI评分,缓解临床症状。DSS模型组小鼠结肠组织SOD活性明显下降(P＜0.01);香连滴丸高剂量组和中剂量组能有效阻遏SOD活性降低。DSS诱导模型组小鼠结肠黏膜组织中MDA含量显著增多,提示DSS致小鼠结肠黏膜氧化损伤。香连滴丸各个剂量组均能减少MDA的产生。本试验结果表明,香连滴丸可以缓解临床症状。提示香连滴丸对溃疡性结肠炎有一定治疗作用。

[1] van K ruiningen H.The ultra structure of macrophages in granulomatous colitis of boxer dogs[J].Veterinary Pathology,1975,12：446-459.

[2] Arai K.Granulomatous colitisin a Boxer dog[J].Journal of the Japanese Veterinary Medical Association,1983,36：29-33.

[3] van Kruiningen H.Granulomatous colitis of boxer dogs comparative aspects[J].Gastroenterology,1967,53：114-122.

[4] Okayasu I,Hatakeyama S,Yamada M,et al.A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice[J].Gastroenterology,1990,98：694-702.

[5] Murthy S N,Cooper H S,Shim H,et al.Treatment of dextral sulfate sodium-induced marine colitis by intracolonic cyclosporine[J].Dig Dis Sci,1993,38：1722-1734.

[6] 周玲玲,方泰惠.复方苦参胶囊对二硝基氯苯所致豚鼠溃疡性结肠炎的保护作用[J].南京中医药大学学报,2004,20(2)：107-109.

[7] 刘颖,王莹.甘草酸二铵抗大鼠溃疡性结肠炎作用及相关机制研究[J].中国新药杂志,2007,16(24)：2027-2031.