高振华 李宁毅 刘凤芝 荆恒 谭帅 姚如永

骨髓基质干细胞片层的制备及其在组织工程骨中应用的初步研究*

高振华 李宁毅 刘凤芝 荆恒 谭帅 姚如永

目的:探讨骨髓基质干细胞(bonemarrow stromal cells,BMSCs)片层(cellsheet)的制备方法，并观察其在实验犬体内构建组织工程骨时的成骨作用。方法：密度梯度离心法获取实验犬骨髓基质干细胞，经成骨诱导培养后，利用温度感应性培养皿(tem perature-responsive culture dish)制备细胞片层后在体外包裹犬同种异体脱钙骨基质(dem ineralized bonematrix,DBM),相差显微镜和扫描电镜观察细胞及片层形态；将复合体植入实验犬背阔肌筋膜下，组织学方法观察术后组织工程骨的骨形成情况。结果：细胞片层成功制备，并与支架材料复合良好，术后16周组织学显示形成类似板层骨的致密骨组织。结论：利用温度反应性培养皿可成功制备BMSC细胞片层，细胞片层包裹支架材料后在实验动物体内可形成具有类似板层骨结构的组织工程骨。

骨髓基质干细胞；细胞片层工程技术；骨组织工程

种子细胞、支架材料和组织构建方式是骨组织工程的三大基本要素。近二十年来，骨组织工程在种子细胞、支架材料方面的研究取得了较多的进展[1]，研究者利用各种种子细胞和支架材料获得了一定大小并具有一定硬度的组织工程骨，但人们更期望获得具有骨皮质和骨松质结构的类似天然骨组织的功能性组织工程骨以满足临床应用时对骨强度的要求。传统的组织工程骨构建方式是将种子细胞悬液接种于支架材料之上，令其粘附、生长、增殖于逐渐降解或吸收的支架材料上并最终形成骨组织，这种方式难以形成类似板层骨的致密骨组织。细胞片层工程技术(cell sheet engineering)是一种收获细胞的新技术，它利用温度反应性培养皿在一定条件下可以无损伤的获取种子细胞和含有细胞外基质(ECM)的一层完整的片状结构，保护了离子通道、生长因子受体和连接蛋白等重要的细胞表面蛋白[2]。细胞片层通过相互叠加并结合支架材料可获得具有3-D结构的组织[3-5]。本文旨在观察细胞片层的制备及应用于骨组织工程时对其成骨的作用。

1.材料与方法

1.1 材料健康杂种犬(青岛大学医学院附属医院动物实验中心提供)6只，12-18月龄，健康杂种犬股骨(自备)，淋巴细胞分离液(天津，TBD)，DMEM培养基、成骨诱导培养基(含地塞米松、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸等，青岛大学医学院附属医院中心实验室)，胎牛血清(杭州，四季青)，相差显微镜(日本，Olympus IX 50)，CO2细胞培养箱(丹麦，Heto CH 200)温度反应性培养皿(日本，Nunc公司)，扫描电镜(日本，JEOL JSM－840)超低温冰箱(日本，SANYO MDF-382E)，冷冻干燥机(美国，SIM FD5508)。

1.2 方法

1.2.1 同种异体脱钙骨基质(dem ineralized bone matrix，DBM)的制备新鲜健康杂种犬股骨，去软组织、骨膜，于－80℃超低温冰箱冷冻6个月，经脱脂、脱钙、脱非胶原蛋白，冷冻干燥机冷冻干燥后，制备成1cm×0.6cm大小的扁圆柱状犬同种异体脱钙骨基质。

1.2.2 骨髓基质干细胞(bonemarrow stromal cells，BMSCs)的培养抽取实验犬髂骨骨髓血，密度梯度离心法分离、提取单个核细胞，将收集到的单个核细胞加入DMEM培养基行原代培养，细胞传代后换用成骨诱导培养基继续培养7天，即可制备细胞片层，倒置显微镜和钙结节染色法观察经成骨诱导后的细胞形态。

1.2.3 BMSCs细胞片层的制备将第2代成骨诱导后的BMSCs，以1×106/cm2的密度接种于温度反应性培养皿(Tem perature responsive culture dishes)中，置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱内培养。待培养皿内的BMSCs增殖融合达90%左右时，将其置于20℃、5%CO2饱和湿度培养箱内培养20-30分钟，细胞片层脱落后，倒置显微镜和扫描电镜下行形态学观察。

1.2.4 组织工程骨支架复合体的构建制备好的DBM经环氧乙烷灭菌处理后，放入培养板中，加入DMEM培养液浸泡12h,中间换液一次。术前1d,无菌纱布吸干DBM水分,0.25%胰蛋白酶消化经成骨诱导后的BMSCs制备成细胞密度为1×107个/m L的细胞悬液，然后将DBM轻轻压缩，在其恢复形态同时将细胞悬液滴加于DBM上，直至DBM完全被细胞悬液浸透后，以便细胞被吸入DBM内部。将脱落的细胞片层3-5层包裹于支架上，将其置于37℃恒温、5%CO2饱和湿度培养箱内培养备用，扫描电镜下观察片层和支架材料的复合情况。

1.2.5 实验动物及分组手术健康杂种犬共6只，雌雄不限，体重20-25kg，静脉麻醉成功后，暴露实验犬双侧背阔肌，将实验组BMSCs片层/经成骨诱导的BMSCs/DBM复合体和对照组经成骨诱导的BMSCs/DBM复合体植入犬背阔肌肌筋膜下，右侧为实验组,左侧为对照组。

1.3 倒置显微镜和扫描电镜观察细胞及细胞片层倒置显微镜下观察细胞的形态和生长情况，茜素红染色法检测钙结节形成。2.5%戊二醛固定细胞片层及支架复合体行扫描电镜观察。

1.4 组织学观察于术后16周取出标本，用4%多聚甲醛固定，EDTA脱钙，脱水，石蜡包埋，横断标本中央制作切片，HE染色，镜下观察骨形成情况。

2.结果

2.1 形态学观察

2.1.1 骨髓基质干细胞原代呈集落样生长，经成骨诱导培养后细胞由长梭形变为短圆形、立方形，细胞增殖速度减慢，茜素红染色可见钙结节形成(见图1)。

2.1.2 将细胞已融合成片的温度反应性培养皿置于20℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养，细胞逐步从培养皿底分离，20m in时细胞与细胞外基质一起脱落可形成完整的细胞片层(见图2)。

扫描电镜下可见细胞密集排列形态、界限不清，细胞呈复层鳞片状生长。将形成的细胞片层接种至支架表面后培养3天，扫描电镜下可见细胞片层良好贴附于支架材料之上，细胞沿支架材料延伸生长(见图3)。

图1 骨髓基质干细胞经成骨诱导培养后的形态学观察。A.经成骨诱导培养7d后骨髓基质干细胞由长梭形变为短圆形、立方形(×100)；B.茜素红染色示钙结节形成(×100)

图2 BMSCs细胞片层制备过程的观察。A.细胞片层脱落后的大体形态；B.相差显微镜下可见细胞自周边整体收缩并从培养皿底脱落(×40)

2.2 组织学观察术后16周，实验组新生骨连接成片，植入物边缘可见类似板层骨结构的致密骨组织形成，部分区域可见初期的哈佛氏系统(Harvard system)形成；对照组亦有新生骨形成，但无明显的致密骨结构(见图4)。

3.讨论

传统的骨组织工程学在收获和转移细胞方面仍存在诸多不足，限制了骨组织工程学的进一步发展。胰蛋白酶在消化细胞的过程中难以控制细胞的消化程度，造成细胞外基质破坏、细胞活性降低和细胞染色体突变机会的增加[6]。单细胞悬液法移植种子细胞的方法，细胞上架率和细胞密度低，难以形成致密的骨组织。因此，骨组织工程学要构建出具有致密骨皮质的功能性骨，必须解决种子细胞收获和转移方面存在的问题。

细胞片层技术是利用温度反应性培养皿进行种子细胞的收获和转移的一项新技术。Yamada,N与Okano等[7]发现将温度反应性的聚合物，即聚异丙基丙烯酰胺(PIPAAm)共价结合到普通聚乙烯培养皿表面可形成温度反应性培养皿(tem perature-responsive culture dishes)。在37℃、5%CO2饱和湿度条件下，培养基的表面呈疏水性，细胞可在温度反应性培养皿表面附着、扩展和增殖。当培养条件变为在20℃、5%CO2饱和湿度时，PIPAAm由疏水性变为亲水性，并在培养皿表面和培养的细胞之间形成水化层，细胞主动从培养基表面脱落形成细胞片层[8]。经细胞片层技术收获的细胞是含有细胞外基质(ECM)的一层完整的片状结构，含有离子通道、生长因子受体和连接蛋白等重要的细胞表面蛋白[9]，保证了细胞之间的信号转导及相互联系，该结构对于构建致密组织尤为重要。温度感应性培养皿可用于从干细胞到上皮细胞等多种细胞的培养。近年来，细胞片层技术在构建肾小球、心肌、肝小叶等三维结构组织的研究方面取得了显著的进展，这为其在骨组织工程中的应用打下了良好的基础。

本实验采用犬自体骨髓来源的间充质干细胞作为种子细胞，它以其来源广泛、增殖能力强、低免疫原性的特点成为骨组织工程常用的种子细胞。实验表明，它能在体外经诱导向成骨细胞分化，并能粘附、生长于温度感应性培养皿表面，通过温度变化脱落形成完整的细胞片层。BMSCs片层中的细胞排列紧密，能良好的附着于脱钙骨基质上生长和增殖，类似自然骨质形成过程中成骨细胞的排列状态。实验组复合体植入体内后在片层覆盖部位形成了类似板层骨结构的致密骨组织，并可见初期的哈佛氏系统形成。

细胞片层技术与传统骨组织工程学相结合可能为骨组织工程的进一步发展提供契机，但一些问题诸如细胞片层的叠加方式、如何应用于大块骨组织的构建等尚需进一步研究。

[1]陈涛，陈立强，李宁毅.富含血小板血浆在颌面组织工程化骨中作用和临床应用的研究进展[J].中华老年口腔医学杂志, 2006,4(4):232-234

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[3]Nishida K,Yam ato M,Hayashida Y,W atanabe K,et al. Corneal reconstruction w ith tissue-engineered cell sheets composed of autologous oralmucosal epithelium[J].N Eng l Med 2004,351(12):1187-1196

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昆明会议消息

由中华口腔医学会老年口腔专业委员会主办，昆明医学院附属口腔医院、云南省口腔医学会、解放军总医院联合承办的第六次全国老年口腔医学学术研讨会拟于2011年4月27日-30日在云南省昆明市召开。会议征文范围：①近年来老年口腔医学学科建设发展情况总结；②老年口腔病诊疗体会；③老年残冠、残根保存修复新技术、新疗法；④老年口腔种植修复经验；⑤老年口腔相关学科新进展。会议期间拟请从事老年口腔医学工作的国内外知名专家做专题讲座和老年疑难病例研讨，并安排与会代表提交的论文做大会交流。欢迎口腔界同行积极投稿，踊跃参会，并请网上投稿。截止日期：2011年3月31日。

联系人：储冰峰chubingf@yahoo.com.cn电话：01066936634郭斌guobin0408@126.com电话：01066936634

中华口腔医学会老年口腔专业委员会

A prelim inary study on fabrication of BMSCs cellsheetand itsapplication in bone tissue engineering

GAO Zhen-hua,LINing-yi,LIU Feng-zhi,JING Heng,TAN Shuai,YAO Ru-yong.(Department of Oral and MaxillofacialSurgery1,Central Laboratory,Shandong 266003,China)

Objective:This study was designed to investigate the fabrication of bonemarrow stromal cells(BMSCs)sheet and its application in bone tissue engineering.M ethods:BMSCswere derived from dog bonemarrow and cell sheetswere prepared w ith temperature-responsive dishes after cells were osteogenic induced.The sheets were w rapped on demineralized bonematrix(DBM),BMSCsand cell sheetwere observed under invertedmicroscope and scanning electron microscope,then the construct was implanted into the bottom fasciae of latissimus dorsimuscle,bone formation was observed with histological methods after operation.Results:BMSCs sheet was successful prepared and new bone formation w ith high density was observed 16 weeks after operation.Conclusion:BMSCs sheet can be fabricated w ith temperature-responsive culture dishes and it can promote new bone formation w ith sim ilar lamellar structure in bone tissue engineering.

Bonemarrow stromal cells;Cellsheetengineering;Bone tissue engineering

R782.2

A

1672-2973(2010)04-0235-04

2010-04-28)

国家自然科学基金资助项目(30872896)山东省自然科学基金资助项目(Y2008C77)

高振华青岛大学医学院附属医院口腔颌面外科硕士生山东266003

李宁毅通讯作者青岛大学医学院附属医院口腔颌面外科主任医师教授山东266003

刘凤芝青岛大学医学院附属医院口腔颌面外科主治医师山东266003

荆恒青岛大学医学院附属医院口腔颌面外科硕士生山东266003

谭帅青岛大学医学院附属医院口腔颌面外科硕士生山东266003

姚如永青岛大学医学院附属医院中心实验室副教授山东266003