宋婷，刘守金，方成武，梁益敏，张鹏，李卫文

(安徽中医学院药学院中药与资源实验室，安徽省中药现代化重点实验室，安徽 合肥 230031)

*刘守金，E-mail：liushjin@hotmail.com

白毛夏枯草止咳化痰化学部位初步生物活性筛选

宋婷，刘守金*，方成武，梁益敏，张鹏，李卫文

(安徽中医学院药学院中药与资源实验室，安徽省中药现代化重点实验室，安徽 合肥230031)

目的初步确定中药白毛夏枯草镇咳、祛痰作用的成分。方法白毛夏枯草的提取物依次用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇进行萃取，得到3个部位。小鼠被灌胃给予石油醚部位2.1g·kg-1,醋酸乙酯部位1.47g·kg-1,正丁醇部位1.71g·kg-1，记录浓氨水引起小鼠咳嗽的潜伏期和5min内的咳嗽次数。此外，计算小鼠呼吸道排出的酚红量。同时，通过3个部位的HPLC图谱的色谱峰平行比较其化学成分。结果3个部位中的醋酸乙酯部位能显著延长潜伏期，减少咳嗽次数，同时增加酚红的排出量。而且，木犀草素和芹菜素被证实存在在这个部位。结论白毛夏枯草醋酸乙酯部位有镇咳、祛痰作用，其中含有的木犀草素和芹菜素可能是其中的2个活性成分。

镇咳；祛痰；高效液相色谱

白毛夏枯草为唇形科筋骨草属植物金疮小草AjugadecumbensThunb.的干燥全草，又称筋骨草；药用始载于《本草拾遗》，具有清热解毒，祛痰止咳，凉血止血的功效。用于治疗肺热咳嗽，咽喉肿痛，痈肿疮疖等症。白毛夏枯草的主要成分有黄酮类、二萜类、有机酸、酚性类等，现代药理研究表明，白毛夏枯草具有镇咳、祛痰、平喘[1-4]、抗炎、抑制支气管病毒[5]、抗肺纤维化[6]、保肝利胆[7]，抑制I型变态反应和促进免疫作用[8]。现在以单味筋骨草部分粉碎、部分乙醇提取物，经混合而制成片剂和胶囊制剂，主要用于治疗急慢性支气管炎、肺脓疡等症，已经收载于《卫生部药品标准·中药成方制剂》第十九册[9]。本实验应用小鼠镇咳、祛痰试验对白毛夏枯草乙醇粗提物的石油醚、醋酸乙酯和正丁醇3个萃取部位进行药效比较，结合高效液相色谱法对3个化学部位的色谱峰进行分析，以初步探讨白毛夏枯草中起镇咳、祛痰作用的有效化学部位，为进一步优化白毛夏枯草制剂生产工艺，提高质量控制水平，提供实验依据。

1 材料与仪器

1.1试药

可待因(青海制药厂有限公司，30mg/片，批号20051002)；酚红，分析纯(上海展云化工有限公司，批号20080625)；木犀草素对照品(中国药品生物制品检定所，批号11520-200504)；芹菜素对照品(纯度99.2%，本实验室自制)；乙醇，石油醚，醋酸乙酯，正丁醇，氯化铵，氨水等实验所用试剂均为国产分析纯；白毛夏枯草药材于2008年3月采自安徽合肥大蜀山，原植物由刘守金教授鉴定为唇形科筋骨草AjugadecumbensThunb.，凭证标本(HF080330)存于安徽中医学院标本馆(ACM)。

1.2动物

昆明种小鼠，体重18～22g，雌雄各半，由安徽省实验动物中心提供，SPF级，合格证号：SCXK(皖)2005-001。

1.3仪器

岛津LC-20AB型高效液相色谱仪，SPD-M20A型检测器(日本岛津公司)；岛津LCSolutionN2010色谱工作站；KQ-50型超声波清洗器(昆山市超声波仪器厂)；UV752CRT型紫外可见分光光度计(上海棱光仪器公司)；402AI超声雾化器(江苏鱼跃医疗责任有限公司)。

2 方法

2.1白毛夏枯草化学部位分离制备

白毛夏枯草药材5250g，依次用95%乙醇、50%乙醇浸泡过夜，加热回流提取，每个浓度提取2次，首次2h，第2次1h，合并提取液，回收乙醇，浓缩至膏状无醇味，得到黑色稠状物1633.12g，加入等量的水混匀，依次用石油醚(60～90℃)、醋酸乙酯以及正丁醇萃取，萃取液回收溶剂，并浓缩得到3个萃取部位。其中石油醚部位110.50g，醋酸乙酯部位77.22g，正丁醇部位89.60g，3个部位分别占药材量的2.10%，1.47%，1.71%。

2.2药效学考察

2.2.1镇咳实验[10]取昆明种小鼠,雌雄各半，随机分成5组，分别灌胃给予生理盐水20mL·kg-1、石油醚提取物2.1g·kg-1、醋酸乙酯提取物1.47g·kg-1、正丁醇提取物1.71g·kg-1和可待因50mg·kg-1，给药30min后将小鼠放入600mL的玻璃瓶内，用402AI超声雾化器向瓶内喷浓氨水30s，取出小鼠观察并记录小鼠咳嗽潜伏期和5min内的咳嗽次数。小鼠咳嗽表现为以其腹肌收缩，同时张大嘴为准。

2.2.2祛痰实验[10]取昆明种小鼠，雌雄各半，随机分成5组，分别灌胃给予生理盐水20mL·kg-1、石油醚提取物2.1g·kg-1、醋酸乙酯提取物1.47g·kg-1、正丁醇提取物1.71g·kg-1和氯化铵1g·kg-1，30min后，分别给各小鼠腹腔注射5%酚红10mL·kg-1，给予酚红30min后颈椎脱臼处死小鼠，解剖小鼠，剥去气管周围组织，剪下自甲状软骨下至气管分支处的一段气管，放入盛有2mL生理盐水的试管中再加1mol·L的NaOH0.1mL，摇匀放置2h，使气管的色素溶出，用752型紫外可见分光光度计于波长546nm处测吸光度A值，根据酚红标准液管的A值作出回归方程，从而计算出酚红排出量。

2.3HPLC指纹图谱分析

2.3.1色谱条件BIOSILU546250-1型色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)；流动相采用二元体系：A为水，B为甲醇，梯度洗脱程序为0min(10%B)、20min(40%B)、30min(40%B)、40min(65%B)、50min(65%B)、60min(75%B)、70min(75%B)、80min(80%B)、90min(80%B)；柱温：30℃；流速：1.0mL·min-1；检测波长：336nm；进样量：20μL。

2.3.2供试品溶液制备

2.3.2.1对照品溶液制备 精密称取木犀草素对照品1.3mg、芹菜素对照品1.0mg，分别加入甲醇溶解，定容至10mL的容量瓶中，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取滤液，即得对照品溶液。

2.3.2.2化学部位溶液制备 取石油醚萃取部位浸膏6.47mg、醋酸乙酯萃取部位浸膏6.59mg和正丁醇萃取部位浸膏6.41mg，分别加入10mL甲醇，定容至10mL的容量瓶中，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取滤液，即得有效部位溶液。

3 结果

3.1白毛夏枯草3个化学部位的镇咳作用比较

结果见表1。白毛夏枯草3个部位与模型组相比较，石油醚部位不能显著延长小鼠咳嗽的潜伏期，减少咳嗽次数(与模型组相比P>0.05)，正丁醇部位只可以明显减少小鼠的咳嗽次数(P<0.05)，而醋酸乙酯部位对浓氨水引起的小鼠咳嗽有明显的抑制作用(P<0.05)。

表1 白毛夏枯草提取物对小鼠的镇咳作用

注：(1)n=10；(2)与模型组相比,*P<0.01；(3)与醋酸乙酯提取物组相比，aP<0.05

3.2白毛夏枯草3个化学部位祛痰作用的比较

结果见表2。与模型组相比,石油醚与正丁醇部位对小鼠的酚红排出量有所增加，经统计学分析，均没有显著差异(P>0.05)；醋酸乙酯部位能显著增加酚红排出量(P<0.05)，具有明显的祛痰作用。

表2 白毛夏枯草提取物对小鼠的祛痰作用

注：(1)n=8；(2)与模型组相比,*P<0.05；(3)与醋酸乙酯提取物组相比，aP<0.05

3.3指纹图谱比较

3.3.1化学部位HPLC图谱比较 按照2.3.1的色谱条件进行分析，分别得到白毛夏枯草药材石油醚萃取部位、醋酸乙酯萃取部位以及正丁醇萃取部位的指纹图谱，结果见图1～3。

图1 白毛夏枯草石油醚萃取部位的HPLC图

图2 白毛夏枯草醋酸乙酯萃取部位的HPLC图

图3 白毛夏枯草正丁醇萃取部位的HPLC图

由图1～3可知，石油醚部位的色谱峰主要集中在40～50min以及60～80min，40～50min的色谱峰响应值在5左右，60～80min出现的色谱峰响应值在10左右；醋酸乙酯部位的色谱峰主要集中在40～50min，色谱峰响应值在100左右；正丁醇部位的色谱峰主要集中在20～50min，色谱峰响应值在50左右。

3.3.2对照品与醋酸乙酯萃取部位HPLC图谱比较 见图4。

图4 木犀草素、芹菜素的HPLC图谱

由图4可知，醋酸乙酯萃取部位的色谱峰集中在40～50min，1号峰、2号峰为40～50min的两个主要峰，保留时间分别为46.20min、48.90min。其中1号峰和2号峰分别为木犀草素和芹菜素。

4 讨论

本实验对白毛夏枯草的乙醇提取物进行有效部位研究，结果显示白毛夏枯草乙醇提取物的石油醚、醋酸乙酯和正丁醇3个部位的HPLC指纹峰存在明显的区别；小鼠的镇咳、祛痰实作用实验表明醋酸乙酯部位的镇咳、祛痰作用显著优于石油醚与正丁醇部位，提示白毛夏枯草乙醇提取物的醋酸乙酯部位可能为活性部位。

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PreliminaryBioactivity-screeningandCharacterizationofAnti-tussiveandExpectorantConstituentsofAjugaDecumbens

Song Ting, Liu Shoujin, Fang Chengwu, Liang Yimin, Zhang Peng, Li Weiwen

(LabofTraditionalChineseMedicineandresourceAnhuiUniversityofTraditionalChineseMedicine,College
ofpharmacy,AnhuiKeylabofmodernizationofTraditionalChineseMedicine,HefeiAnhui230031,China)

Objective: To identify potential anti-tussive and expectorant constituents ofAjugadecumbens, a traditional Chinese medicine.MethodsThree factions were separated with petroleum ether, ethyl acetate,

and n-butyl alcohol from crude alcohol extract of . The latency and frequency of coughs within min were counted in mice induced by ammonia water, after oral administration of the three factions at single doses of .g·kg, .g·kg, and .g·kg, respectively. Besides, amount of Phenol red secreted from respiratory tract was sampled. Meantime, the finger-prints of the three factions were profiled by HPLC to compare the chemical compositions in parallel. : Among the three factions, the ethyl acetate faction significantly elongated latency and cut down frequency, as well as to increase the secretion of phenol red. Moreover, luteolin and apigenin have been confirmed present in the active ethyl acetate faction. : The ethyl acetate faction of may exert effects, in which luteolin and apigenin were likely to be bio-active components.

Antitussis；Expectorant；High performance liquid chromatography

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