杨建峰,石晓鹏,赵丹,邓峰美,王振焕,陈雄英,王刚,何芳

(石河子大学医学院/新疆地方与民族高发病教育部重点实验室,石河子832002)

TGF-β1 rs1800469基因多态性与新疆汉族原发性高血压的相关性研究

杨建峰,石晓鹏,赵丹,邓峰美,王振焕,陈雄英,王刚,何芳

(石河子大学医学院/新疆地方与民族高发病教育部重点实验室,石河子832002)

为研究转化生长因子β1(TGF-β1)基因单核苷酸多态(SNP)rs1800469及血浆水平与新疆汉族原发性高血压(EH)的关系。采用整群抽取随机抽样的方式,以新疆沙湾县732名汉族人(EH组365人,对照组367人)为研究对象,进行流行病学调查和临床检查,并采集血样。用双抗体夹心法(ELISA试剂盒)测量 TGF-β1血浆浓度。SNaPshot方法进行基因分型。rs1800469基因型及等位基因在 EH组和对照组分布差异无显著性(P>0.05)。TGF-β1血浆水平在EH组与对照组各基因型和等位基因之间无差异(P>0.05)。结果表明:在新疆汉族人群中TGF-β1基因 rs1800469位点存在C/T分子变异,与原发性高血压缺乏关联。同时 TGF-β1基因rs1800469位点多态性与 TGF-β1血浆水平不相关。

TGF-β1;基因多态性;血浆水平;高血压;新疆汉族;单核苷酸多态

Abstract:We investigate the relationship between the single nucleotide polymorphism rs1800469 in transforming growth factor-β1(TGF-β1)gene,protein levels and essential hypertension(EH)in the Han population in Xinjiang.Based on the case-control study,we selected 732(365 EH patients,367 controls)Han Chinese people from the Boertonggu countryside of Shawan region in the Xinjiang Uygur Autonomous Region of China by random cluster sampling.After questionnaires and physical examinations,we collected blood samples,and the blood levels of TGF-β1 were quantified using sandwich ELISA.The polymorphisms of TGF-β1 in the studygroups were detected with SNaPshot system.The frequencies of genotypes and alleles of rs1800469 had no differences between EH and controls(P>0.05).There were no differences of TGF-β1 levels between the different genotypes and alleles in rs1800469 of TGF-β1 gene(P>0.05).The result showed there was a C to T substitution at rs1800469 of TGF-β1 gene,but there was a lack of association between the mutation of TGF-β1 gene and essential hypertension in the Han of Xinjiang.There was no association between the rs1800469 and TGF-β1 blood levels in them.

Key words:TGF-β1;gene polymorphism;blood level;hypertension;Han in the Xinjiang;single nucleotide polymorphism

转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是一个多功能生长因子 ,能调节细胞增殖和分化、胚胎形成、伤口愈合和血管再生。近年来,随着对 TGF-β1的深入研究,发现其系一基因家族编码产物,对血管平滑肌细胞增殖、成纤维细胞增生、细胞外基质沉积以及介导心血管疾病的发生起着重要作用。研究发现在众多细胞生长因子中,TGF-β1基因变异与高血压及其靶器官损害的关系非常密切[1]。对于 TGF-β1基因变异与新疆汉族EH关系目前未见报道。

本文采用SNaPshot SNP方法在新疆汉族人群中对 TGF-β1基因多态进行分析,探讨 rs1800469与新疆汉族高血压的相关性,以阐明 TGF-β1基因多态、血浆水平和环境因素交互作用及与EH的关系,以便寻找新疆汉族EH可能的遗传风险因子,揭示新疆汉族EH的遗传易感机制。

1 对象与方法

1.1 研究对象

在新疆天山北麓塔城地区沙湾县博尔通古乡牧区、元兴宫村、红土庄字村及乌拉乌苏镇,采取整群抽取随机抽样,选择年龄18岁以上72岁以下,至少3代在本地居住的汉族居民,非一、二级亲属,无血缘关系,无异族通婚史。

病例组纳入标准:根据1999年 WHO/ISH诊断标准,收缩压 ≥140 mmHg和(或)舒张压 ≥90 mmHg,常规检查排除继发性高血压、心肌梗死、过量饮酒、服用避孕药史,无糖尿病、甲状腺及肝肾疾病史等。

本次共调查2300人,随机选取汉族732人作为研究对象,EH组365人(男性160人,女性205人,平均年龄52.39岁),对照组367人(男性143人,女性224人,平均年龄47.84岁)。

由于本研究需测量 TGF-β1血浆水平,因此尚需排除其它影响 TGF-β1血浆浓度测定的因素(如动脉粥样硬化、肝硬化、肿瘤、肾脏疾病等)。

1.2 基因组DNA提取

采用酚-氯仿法提取DNA。

1.3 TGF-β1基因片段扩增

设计PCR引物用于扩增包含SNP位点的片段,及紧邻SNP位点的延伸引物用于单碱基延伸。检索美国国立生物技术信息中心(NCBI)公共数据库中SNP位点序列,用 Primier primer 5软件设计PCR引物及延伸引物。引物如下:

上游:5′-cttagccacatgggaggtgctc-3′,

下游 :5′-ggagagtcaggctgggaaacaa-3′。

PCR反应体系:10×buffer 2μL,25 mm MgCl21.2μL,dNTP 0.6μL,多重 PCR引物 2 μL,Hotstar Taq聚合酶 0.2μL,DNA模板 1μL,去离子水 13μL,总体系 20μL。

1.4 TGF-β1基因片段的多态性检测

利用SNaPshot SNP分型技术进行SNP位点分型。PCR产物延伸反应即单碱基延伸反应。单碱基延伸引物序列如下:CCTCCTGACCCTTCCATCC。

延伸反应体系(10μL)包括 5μL SNaPshot Multiplex Kit(ABI),2μL纯化后 PCR产物,1μL延伸引物,2μL超纯水。PCR循环程序:96℃预变性1 min;28×(96℃变性10 s,50℃退火5 s,60℃延伸30 s);60℃充分延伸1 min;4℃保存。延伸产物纯化,在10μL延伸产物中加入1U SAP酶,37℃温浴1h,然后 75℃灭活 15 min。延伸产物上ABI3130XL测序仪,取0.5μL纯化后的延伸产物,与0.5μL Liz120 SIZE STANDARD,9μL Hi-Di混匀,95℃变性5 min后上ABI3130XL测序仪。

将在测序仪上收集的原始数据用 GeneMapper 4.0(AppliedBiosystems Co.,Ltd.,USA)来分析,进行基因型判断。

1.5 TGF-β1血浆浓度测定

用ELISA试剂盒测定血浆水平,试剂盒购自上海西唐生物科技有限公司(Westang,Shanghai,China)人类 TGF-β1 ELISA试剂盒。

1.6 统计学分析

采用SPSS13.0统计学软件对数据进行统计学处理。计算两组基因型频率以确认符合 Hardyweinberg平衡。

计量资料用均数±标准差(x ±S)表示,两组间比较采用 t检验,多组间比较用方差分析,两个计量资料之间有无相关采用相关分析。

计数资料组间比较采用χ2检验。由基因型频率计算等位基因频率,组间等位基因频率和基因频率比较采用χ2检验,不同基因型与 TGF-β1血浆水平的关系比较采用单因素方差分析(One way ANOVA),P<0.05有统计学差异。

2 结果

2.1 汉族EH组与对照组的临床相关指标比较

比较结果见表1。由表1可知:各指标如收缩压、舒张压、平均动脉压、脉压、体重指数、腰臀比、空腹血糖、总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白的平均水平,两组间比较均有差异(P<0.05),EH组均高于照组;其余指标如年龄、高密度脂蛋白两组间均无差异(P>0.05)。

表1 EH组与正常对照组临床相关指标比较Tab.1 Clinical parameters of essential hypertension and contro subjects x±S

2.2 汉族tSNP及单位点单碱基延伸电泳峰型

结果见图 1。图 1中橙色峰(A)为 SIZE STANDARD,蓝色(B)、绿色(C)、红色(D)、黑色峰(E)分别代表延伸加入 ddGTP、ddATP、ddTTP和ddCTP的延伸产物,峰下面标注的等位基因(如果用的延伸引物是正向的,则跟延伸加入的碱基一致,如果是反向的,则跟延伸加入的碱基互补)。

图2为rs1800469位点单碱基延伸电泳峰型图。根据单峰、双峰来判断基因型,单峰为纯合基因型,双峰为杂合基因型。

图1 汉族不同SNP单碱基延伸电泳峰型Fig.1 SNaPshot electropherogram result of all SNPs in Han groups

图2 rs1800469位点单碱基延伸电泳峰型Fig.2 SN Pshot electropherogram result of rs1800469(C/C、C/T、T/T)

2.3 TGF-β1基因型及等位基因在新疆汉族EH组与对照组中的分布及患病风险估计

rs1800469位点基因型分布均符合 Hardy-Weinberg平衡(P>0.05),提示该人群有较好的代表性。表2中,rs1800469位点在EH组与对照组间均无差异。

表2 汉族rs1800469位点基因型及等位基因分布及患病风险Tab.2 Distribution of TGF-β1 genotypes and alleles in case and control groups in Han

2.4 TGF-β1基因多态性与新疆汉族TGF-β1血浆水平的关系

rs1800469位点基因型及等位基因在汉族人EH组和对照组中 TGF-β1血浆水平的比较如表3所示,各位点基因型在 EH组与对照组的 TGF-β1血浆浓度差异均无统计学意义(P>0.05)。等位基因在EH组与对照组的 TGF-β1血浆浓度差异亦无统计学意义(P>0.05)。单因素方差分析(One-Way ANOVA)发现 EH组或对照组中各基因型TGF-β1血浆浓度差异无统计学意义,T检验发现等位基因在EH组或对照组中 TGF-β1血浆浓度差异无统计学意义。由此可以看出各位点基因多态性与汉族 TGF-β1血浆水平无关。

表3 汉族rs1800469基因型及等位基因在汉族EH组和对照组中TGF-β1血浆水平的比较Tab.3 TGF-β1 protein levels in different genotypes and alleles of rs1800469 in case and control groups in Han±S

表3 汉族rs1800469基因型及等位基因在汉族EH组和对照组中TGF-β1血浆水平的比较Tab.3 TGF-β1 protein levels in different genotypes and alleles of rs1800469 in case and control groups in Han±S

注:★表示One-Way ANOVA分析发现 EH组或对照组中3种基因型之间差异无统计学意义;△表示 T-Test分析发现EH组或对照组中两种等位基因之间差异无统计学意义。

基因型及等位基因EH组(n=365/人)对照组(n=367/人) t P rs1800469 CC 31.50±11.36 31.43±9.25 0.012 0.990 CT 30.07±11.62 29.07±12.20 0.300 0.765 TT 30.80±8.25 23.57±7.29 1.566 0.121 P=0.942★P=0.278★C 31.50±10.78 31.43±13.34 0.017 0.986 T 30.36±9.22 27.52±10.78 1.496 0.135 P=0.887△P=0.146△

3 讨论

目前EH的病因尚不完全清楚,只是认识到某些因素的存在与EH发生有关,包括环境与遗传两个方面的因素,属于多基因、多因素及两者交互作用引起的复杂性状疾病。不同的基因背景可以造成不同人群对于某些疾病存在不同的易感性。分析临床相关指标比较发现:汉族群体中,血压包括收缩压、舒张压、平均动脉压、脉压,在 EH组和对照组有显著差异。研究结果提示:新疆汉族高血压患者中普遍存在着高血压知晓率、服药率和控制率低的状况。大规模临床研究证实,对高血压病人血压的控制尤其是收缩压能减少脑卒中与心力衰竭的发生。因此,长期服用药物治疗高血压同时建立健康的生活方式,合理膳食,适量运动,戒烟限酒和调整心理平衡,只有这样才能提高高血压治疗率和控制率,有效降低高血压病发病率、致残率及死亡率,提高患者的生活质量[2]。同时,超重和肥胖是EH的危险因素,与文献报道一致[3-6],尤其是以肥胖更显著。已有研究表明,血脂代谢异常(主要是指血浆中甘油三酯和总胆固醇以及低密度脂蛋白的浓度升高)是动脉粥样硬化的主要危险因素之一,本研究调查结果显示汉族EH人群中血浆总胆固醇、甘油三酯以及低密度脂蛋白较正常血压人群明显增高,进一步证实了超重、肥胖及血脂紊乱与 EH的关系密切。上述研究结果提示,控制体重,降低甘油三酯、总胆固醇及血糖浓度,减少饮酒量,增加蔬菜摄入,有助于预防高血压的发生。

本研究 TGF-β1rs1800469基因型频率在新疆汉族总人群分布 CC、CT、TT分别为24.7%、50.5%、24.7%,内地汉族则为 30.0%、51.1%、19.9%[6],两者多态性分布差异无显著性。瑶族人为46.0%、43.3%、10.7%[6],德 国 人 为 42.6%、45.4%、12.0%[7],英国人为 44.4%、46.2%、9.4%[8],均与我们报道的rs1800469基因型频率分布存在差异。由此可以看出 TGF-β1 rs1800469基因多态性的分布情况在不同民族具有很大的差异性。

新疆汉族 EH组和对照组 TGF-β1 rs1800469基因型及等位基因频率无差异,可能与以下因素有关:(1)可能是本研究的样本量不够大,提供的信息量有限。(2)SNP在不同人群中分布频率可能不一样,杂合程度也未必相同[9],血压遗传度在不同人群间差异较大,可能正是由于这种分布差异,SNP在关联分析时提供的信息量也可能存在较大的差别。(3)疾病发生发展的机制非常复杂,可能存在很多未知通路,或者存在连锁不平衡、基因多效性等。所以每个多态位点的存在并不是单独起作用,它们之间既可表现为协同也可表现为拮抗[10]。TGF-β1基因型是调节 TGF-β1血浆水平的重要调节因素之一,来自英国170对孪生姐妹[11]和中国人群的报道也证实了血浆中 TGF-β1的浓度rs1800469T/T较C/T、C/C为高[11-12]。在本研究中,发现新疆汉族中TGF-β1 rs1800469 基因型与 TGF-β1 血浆水平都不相关。上述研究结果表明 TGF-β1基因型很可能是 TGF-β1血浆水平的重要调节因素之一,但rs1800469C>T不同基因型与 TGF-β1血浆水平之间关系在不同种族、地域间是否存在差异以及产生差异的机制,尚有待进一步研究证实。

综上所述,在新疆汉族人群中存在 TGF-β1 rs1800469基因多态性,其分布频率在 EH和对照组中无差异。TGF-β1基因型与血浆水平无相关性。除此之外,环境因素在新疆汉族人群EH高发的机制中可能占有重要地位,其中超重、肥胖、血脂代谢紊乱是EH危险因素。

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Relationship between the rs1800469 Polymorphisms of TGF-β1 Gene and Essential Hypertension in the Han of Xinjiang

YANGJianfeng,SHI Xiaopeng,ZHAO Dan,DENG Fengmei,WANG Zhenhuan,CHEN Xiongying,WANG Gang,HE Fang
(Medical College of Shihezi University/Ministry of Education Key Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Diseases,Shihezi 832002,China)

R446.1

A

1007-7383(2010)05-0576-06

2010-01-07

国家自然科学基金项目(30760077)

杨建峰(1981-),男,硕士生,专业方向为心血管病理生理研究。

何芳(1964-),女,教授,从事心血管病理生理研究;e-mail:fangf2002shz@126.com。