王白羽,任丽彤,曹连莆,孔广超

(石河子大学麦类作物研究所,石河子 832003)

六倍体小黑麦耐盐相关基因cDNA-AFLP技术体系的建立

王白羽,任丽彤,曹连莆,孔广超

(石河子大学麦类作物研究所,石河子 832003)

为建立和优化六倍体小黑麦耐盐相关基因克隆cDNA-AFLP技术反应体系,并探索其应用效果,以对盐胁迫反应不同的4个六倍体小黑麦品种(系)为材料,对其在0.15 mol/L氯化钠胁迫72 h的cDNA-AFLP技术中DNA聚合酶浓度、模版浓度和引物筛选等过程进行了摸索和优化。结果显示,建立了以1.0 U Taq DNA聚合酶为扩增酶、预扩产物稀释20倍、EcoR I和Mse I为内切酶及其相应接头为引物的六倍体小黑麦耐盐相关基因cDNAAFLP技术体系,并从64对引物组合中筛选出稳定、高效的引物组合以及236个差异片段。结果表明,该cDNAAFLP技术体系更易分离出差异性片段,为六倍体小黑麦在盐胁迫及其它逆境环境下的基因克隆提供一种有效手段。

小黑麦;耐盐基因;cDNA-AFLP;差异性片段

Abstract:To construct a more efficient cDNA-AFLP system and explore its usage for gene clone related with salt stress in triticale.Four triticale varieties or lines with sensitive or tolerant to salt were used to be stressed by 0.15 mol/L NaCl for 72 hours as materials,the courses of DNA Polymerase concentration,template concentration,primer screening in the cDNA-AFLP technolyge were optimized.The result showed that we constructed the cDNA-AFLP system that 1.0 U Taq DNA polymerase for pre-amplication enzyme,the 20 times of diluted pre-amplication product,EcoR I and Mse I and their realted adapters for primers,and several stable,edible primer combinations were screened out of 64 pairs of primers and 236 differentially expressed cDNAs were obtained with the newly established cDNA-AFLP system.The result indicated that cDNA-AFLP could easily isolate more differential cDNAfragments than usual AFLP techniques and it will provide a powerful method for molecular cloning of genes in triticale related with salt stress.

Key words:triticale;salt stress;cDNA-AFLP;differentially expressed cDNAs

盐碱是影响全球大田作物持续生产的主要非生物逆境之一,它影响了作物的正常生长,限制了作物产量潜力的正常发挥。据统计,在影响作物产量的各种环境因素中,干旱和盐碱所造成的减产损失高达40%以上[1]。全球约有9亿hm2的土地存在不同程度的盐碱化,占世界总耕地面积的20%,其中中国盐碱土面积约2000万hm2[2]。因此,如何开发和利用盐碱化土壤,提高作物产量和品质已成为盐碱地农业、海水灌溉农业中亟待解决的重要问题[3]。

小黑麦是由小麦和黑麦经属间人工杂交、应用染色体加倍技术育成的第一个新物种[4]。其不仅具有小麦籽粒高产、优质的特性,也继承了黑麦生物学产量高,对病、虫害以及干旱、瘠薄、盐碱等不良环境条件耐性较强的优点。小黑麦的耐盐碱性及其生物改良盐碱地的作用日益受到关注[5]。但长期以来人们对小黑麦耐盐机理知之甚少。从基因表达的差异入手,寻找与小黑麦耐盐性相关的基因,并对其功能进行分析,对于深入了解小黑麦耐盐碱机理具有重要的意义。

cDNA-AFLP(cDNA amplifiedfragment length polymorphism)是Bachem等[6]在基因组DNA的选择性扩增限制性片段即AFLP(amplified fragment length polymorphism)的基础上创造出来的一种用于RNA指纹分析的方法,该法将 RT-PCR(reverse transcripted PCR)和AFLP技术结合起来,采用 PCR中较高的退火温度和特定引物对包含信息较多的内部特异片段进行选择性扩增,从而增加了反应的严谨度,使其比 DDRT-PCR(differential display reverse transcriptase PCR)的可靠性和可重复性大大提高[7]。

本研究以六倍体小黑麦为材料,通过对限制性酶切及连接、PCR预扩增、选择性PCR扩增过程的摸索,旨在优化小黑麦耐盐相关基因cDNA-AFLP技术反应体系,并从中筛选稳定、高效的引物组合。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

供试的4个六倍体小黑麦品种(系)为新小黑麦3号、新小黑麦 5 号、98-5981、28ITSN-51,均为石河子大学农学院麦类育种课题组提供。其中新小黑麦3号、新小黑麦5号在前期研究中表现为耐盐碱品种,而98-5981和28ITSN-51对盐碱反应表现较为敏感。

本研究使用的胁迫前后的RNA模板为4个品种等比例混合的RNA。

1.1.2 主要试剂

Trizol试剂购自 TIAN GEN生物技术公司(北京),cDNA合成试剂盒购自 Takara生物技术公司(大连)。所用DNA限制性内切酶 EcoRI、MseI以及 T4DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、接头及引物都来自购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司的AFLP试剂盒。

1.2 方法

1.2.1 盐胁迫处理

将4个小黑麦品种(系)的种子在发芽盒中进行发芽,待长到一叶期时,转至培养盒中用 Hoagland营养液水培7 d左右[8],长至二叶一心后分为2组,一组采用0.15 mol/L氯化钠胁迫处理72 h,另一组(未胁迫)为对照。

1.2.2 RNA的提取

分别采集经氯化钠胁迫和对照组的新鲜、幼嫩叶片,利用 Trizol法提取 RNA[9]。

1.2.3 cDNA的获得

采用反转录cDNA合成试剂盒将获得的RNA合成双链cDNA[10],做为AFLP分析模板。

以管家基因Actin为内参,检测所合成cDNA模板的质量,正义引物为:GGAAAAGTGCAGAGAGACACG,反义引物为:TACAGTGTCTGGATCGGTGGT[11],扩增出目的片段后用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.5 酶切连接与预扩增模板的制备

采用EcoRⅠ和MseⅠ酶对cDNA样品进行双酶切,后用EcoRⅠ和MseⅠ接头连接,制备预扩增反应模板,并对酶浓度和预扩增模板浓度进行梯度设计。

1.2.6 选择性扩增

各选用8个 EcoRⅠ和MseⅠ引物,组合成64对选择性扩增引物,其序列如下:E+CA、E+CT、E+CC、E+CG、E+AG、E+GC、E+AC、E+GG、M+TT、M+TA、M+TC、M+TG、M+AA、M+AT、M+AC、M+AG。

1.2.7 凝胶电泳

选择性扩增产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳,验证是否有产物以及产物分子量大小范围后,采用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行扩增产物分离[12]。

1.2.8 银染显色

宁夏地处我国西部地区，是少数民族聚居区，也是典型的欠发达省区。其中，位于南部地带的西海固地区是国家14个集中连片特困地区之一，也是被习近平总书记深切关注，称为“苦瘠甲天下”的贫瘠地区。近年来，宁夏扶贫工作取得显著成绩，但仍有15万户建档立卡贫困户、58万建档立卡贫困人口，且每年因病、因残致贫高达4万余户，每年因病、因灾、因意外再次返贫的人口也高达1万余户。随着较易脱贫的人口逐步完成脱贫，扶贫开发工作迈入“深水区”，如何解决剩余贫困人口的脱贫问题，成为脱贫攻坚工程的重点。

在文献[13]中方法的基础上,对硝酸银的用量、银染时间以及显影的用量及操作作了改进,即银染液为1.6 g AgNO3+1.5 mL甲醛+1 L去离子水,染色时间为25 min,显影时间缩短为5 min左右。

2 结果与分析

2.1 cDNA的合成

利用 Trizol法所提取的六倍体小黑麦RNA经电泳分析,结果(图1)表明:所提取的RNA完整,无拖尾和降解现象,也无明显的DNA和蛋白质残留,且其OD260/OD280值均为1.8～2.0。

用反转录cDNA试剂盒将RNA反转录为双链cDNA,以Actin引物扩增目的片段,电泳后在150 bp出现较亮的条带(图2),即Actin基因。这表明所提取的cDNA完整,且其质量良好,同时由 RNA反转录合成cDNA获得了成功,这些均表明由其反转录合成的cDNA适于AFLP标记的分析。

图1 提取的小黑麦RNA的电泳图谱Fig.1 Electrophoresis pattern of RNA from tirticale

图2 合成的cDNA质量电泳图谱Fig.2 Electrophoresis pattern of cDNA from tirticale

2.2 Taq DNA聚合酶浓度对预扩增结果的影响

设定4个 Taq DNA聚合酶浓度梯度为0.6、0.8、1.0、1.2 U。由图3可见,当 Taq DNA 聚合酶为0.8 U和1.0 U时,均在500～250 bp处出现了弥散带,而在其他浓度时,均没有扩增到产物。这表明0.8 U和1.0 U的Taq DNA聚合酶较为理想。

在以上 Taq DNA聚合酶浓度的基础上,最终建立了AFLP预扩增反应体系:2.0μL模板,1.0 μL Pre-ampmix(10μmol/μL),2.5μL 10×Buffer,0.5μL dNTP(2.5 mmol/L),0.5μL Taq DNA聚合酶(2 U/μL),18.5μL水。

反应程序:94℃2 min;94℃30 s,56℃30 s,72℃,80 s,30个循环;72℃5 min。

2.3 模板浓度对选择性扩增的影响

AFLP技术对模板质量要求较高,而模板DNA的量在数十倍的范围内变动都不会对扩增的结果产生明显影响。如图4所示,预扩产物在稀释20倍和50倍后分别作为模板进行选择性扩增时,扩增结果基本上一致。而稀释50倍的预扩产物在重复试验时扩增效果不稳定,因此选择稀释20倍预扩产物作为模板为宜。

图3 不同Taq DNA聚合酶浓度预扩电泳图谱Fig.3 Electrophoresis pattern for the products of PCR amplification under different Taq DNA polymerase concentration

图4 预扩产物稀释不同倍数的选扩图谱Fig 4 Electrophoresis pattern for the products of PCR amplification under different preamplication products concentration

在此基础上建立了适合的AFLP选择性扩增反应体系:3.0μL模板,0.8μL EcoRⅠ选扩引物(10μmol/L),0.8μL MseⅠ选扩引物 (10μmol/L),2.5μL 10×Buffer,0.45μL dNTP(10 mmol/L),0.31μL Taq DNA 聚合酶(2 U/μL),12.324 μL水。

反应程序:94℃2 min;94℃30 s,65℃30 s,72℃80 s,退火温度每个循环降0.7℃、14个循环;94℃30 s;55℃30 s;72℃80 s,23个循环;72℃5 min。

2.4 引物筛选

由图5可知,E+CC/M+A G、E+CT/M+AG等引物可以扩增出较稳定的条带。图5还显示挑选差异片段的5种情况:

1)在盐胁迫处理和对照中的表达无明显的差异,如图5中的第7和第8泳道;

2)某一基因在对照中的表达比在盐胁迫处理的样品强,例如图5中的A指示的谱带;

3)某一基因在样品中的表达比对照强,例如图5中B指示的谱带;

4)某一基因在对照中表达而在盐胁迫后不表达,例如图5中C所指示的谱带;

5)某一基因盐胁迫后才表达,而在对照样品中无表达,例如图5中的D所指示的谱带。

图5 不同引物的聚丙烯凝胶电泳图谱Fig.5 Polyacrylamide electrophoresis pattern for the products of amplified by different primers

2.5 差异片段比对

经64对引物的筛选共挑选出了236个差异片断(表1),从中随机选取100个进行二次扩增,已成功扩增并克隆、测序的差异性片段共33个,其它的可能为假阳性。

表1 筛选出的具差异性引物组合及差异片段数目Tab.1 The screened different primer combinations and differentially expressed cDNAs

将这33个片段在NCBI中通过Blast-X比对,结果表明:有30个与已知特定基因具有同源性,另有3个未找到具有同源性的已知基因或序列无任何同源性,可能是尚未发现的新基因。在30个已知基因的同源片段中有5个与耐盐性密切相关,如磷酸酰丝氨酸脱羧酶、谷氨酰胺依赖天冬酰胺合成酶、碳酸酐酶、抗性蛋白;其余的25个片段分别与高分子量麦谷蛋白基因,光系统II 32kDa蛋白,光系统I疏水蛋白(PSI)等基因具有同源性。

3 讨论

在cDNA-AFLP技术中,当转录产物高度表达时,扩增条带强度的高低能直接反应出基因表达量的差别,所获得的转录衍生片段可最大限度的提供基因编码区的信息,这使得cDNA-AFLP技术成为一种分离差异表达基因的有效方法[14]。

影响cDNA-AFLP结果的因素有很多,如 Taq DNA聚合酶的浓度、预扩模板的浓度、限制性内切酶的组合等。其中选择限制性内切酶的组合是最难把握的,因为限制性内切酶要最大限度地覆盖mRNA池,这样才可以涵盖所有表达基因的信息[15],也就要求对作物的遗传信息有更全面的了解。

本研究建立了以 Trizol法提取RNA、1.0U北京鼎国生物技术有限公司的 Taq DNA聚合酶为与扩增酶、预扩产物稀释20倍、EcoR I和 Mse I为内切酶及其相应接头引物为主要技术内容,同时结合增加 AgNO3用量以及缩短显色时间的cDNAAFLP技术体系。该技术体系比以往在作物上使用的AFLP更易分离出差异性片段,其可靠性和可重复性也有了较大提高[15],同时突破了常规的银染染色方法,所得的小黑麦图谱条带清晰、背景色淡,其染色结果更利于数据的分析。

本实验利用cDNA-AFLP技术从小黑麦中克隆了一些与盐胁迫反应相关的cDNA片段,它们有可能在小黑麦的耐盐中起重要或决定性作用。获得的这些基因根据已知的 EST序列进行了部分基因的全长cDNA的克隆,获取了抗盐碱相关基因碳酸酐酶,其与在 GenBank公布的大麦碳酸酐酶基因的同源性为79%,这为进一步研究小黑麦盐碱相关基因奠定了一定基础。

该cDNA-AFLP技术是首次应用于小黑麦分子标记方面,不仅适合小黑麦逆境环境下基因的差异性片段分离,也可为研究其它麦类作物通过RNA反转录和差显途径进行基因分子克隆提供参考。

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Contruction of cDNA-AFLP Technique for Genes Related to Salt Stress in Hexopliod Tirticale

WANGBaiyu,REN Litong,CAO Lianpu,KONG Guangchao
(Institute of Triticeae Crops,Shihezi University,Shihezi 832003,China)

S512.4

A

1007-7383(2010)04-0404-05

2009-10-11

国家自然科学基金项目(30960194)

王白羽(1984-),女,硕士生,专业方向为作物高产、优质、抗性性状的育种。

孔广超(1970-),男,副教授,从事作物遗传育种研究;e-mail:kgch_agr@shzu.edu.cn。