庞 锐，潘丽军*，姜绍通，吴学凤

(合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽 合肥 230009)

N+注入诱变选育混合糖发酵L-乳酸高产菌株

庞 锐，潘丽军*，姜绍通，吴学凤

(合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽 合肥 230009)

采用低能N+注入技术对米根霉As3.819进行诱变选育，以提高该菌株利用混合糖(葡萄糖、木糖)发酵生产L-乳酸的能力。实验结果表明，菌株的存活率曲线呈典型的“马鞍型”，在注入剂量为50×2.5×1013ions/cm2时具有较高的正突变率。选育获得突变株N50-7，其L-乳酸产量为79.42g/L，比出发菌株提高了17.75%，且遗传稳定性较好。对突变株N50-7的发酵培养基进行了初筛，在混合糖150g/L(葡萄糖100g/L、木糖50g/L)、(NH4)2SO4 3.0g/L、KH2PO4 0.3g/L、MgSO4·7H2O 0.3g/L、ZnSO4·7H2O 0.4g/L的条件下发酵72h，L-乳酸产量最高达到103.81g/L，较初筛前提高了30.71%。

离子注入；米根霉；诱变育种；混合糖；L-乳酸

L-乳酸是一种重要的有机酸，在食品、饮料、饲料、现代医药、现代农药、日用化工、造纸及电子等行业具有广泛的应用前景，是21世纪最具发展前途的有机酸之一[1-2]。随着以L-乳酸为原料，制成可生物降解的新型环保材料——聚乳酸(PLA)加工和应用技术的进步[3-4]，作为原料的L-乳酸受到了人们的广泛关注，已成为当今世界最热门的生化产品之一，市场需求量巨大[2]。

木质纤维原料是地球上最丰富且价廉的可再生资源，水解得到同时含有葡萄糖和木糖等单糖的混合糖，是潜在的重要生物转化原料[5-7]，对于降低L-乳酸生产成本具有重要意义。然而传统发酵技术是建立在利用淀粉质原料的基础上，对五碳糖利用度低。因此，筛选混合糖高效利用菌株，研究混合糖条件下微生物定向生物合成，是利用廉价可再生资源获得能源产品和化学品的重要方向[8]。

离子注入诱变育种是集化学诱变、物理诱变为一体的综合诱变方法，不仅影响细胞的生理生化功能，还可使细胞中的染色体畸变、导致DNA链碱基的损伤、断裂，从而使遗传物质在基因水平或分子水平上发生改变或缺失。因此，其能够在低剂量注入的情况下显著提高生物的变异率，获得损伤轻、突变率高、突变谱广、遗传稳定的诱变效果[9-11]。离子注入技术被广泛地应用于微生物优良菌株的选育和改良研究中，为筛选高效的正突变菌株提供了广阔的空间。

本工作拟利用N+注入的方式对实验室保藏菌株米根霉As3.819进行诱变处理，筛选能够利用混合糖发酵高产L-乳酸的米根霉菌株，并对发酵培养基进行初筛，以获得米根霉利用混合糖发酵L-乳酸的适宜条件，为木质纤维原料生产L-乳酸打下良好的基础。

1 材料与方法

1.1 菌种

米根霉(Rhizopus oryzae)As3.819 本实验室保藏。

1.2 培养基

斜面保藏培养基：PDA培养基。

筛选培养基：葡萄糖平板(g/L)：葡萄糖20、马铃薯200、琼脂20、溴甲酚绿0.1、pH值自然；木糖平板(g/L)：木糖20、马铃薯200、琼脂20、溴甲酚绿0.1、pH值自然。

种子培养基(g/L)：葡萄糖80、(N H4)2SO44、KH2PO40.3、ZnSO4·7H2O 0.44、MgSO4·7H2O 0.25、CaCO310(单独灭菌)，pH值自然。

初始发酵培养基(g/L)：葡萄糖80、木糖40、(NH4)2SO44、KH2PO40.3、ZnSO4·7H2O 0.25、MgSO4·7H2O 0.35、CaCO360(单独灭菌)，pH值自然。

以上培养基皆于121℃灭菌15min。

1.3 培养方法

斜面及平板培养：32℃恒温培养箱中培养3～5d。

液体种子培养：100mL三角瓶装液量20%，接种孢子悬液(浓度为1×106个/mL)2mL，摇床转速200r/min，32℃振荡培养16h。

摇瓶发酵培养：250mL三角瓶装液量20%，接种量10%，32℃、200r/min振荡培养72h。

1.4 低能N+注入工艺与样品处理

取新鲜活化斜面，用无菌水洗脱后制成浓度为1× 107个/mL的孢子悬液，吸取0.1mL均匀涂布于无菌培养皿上，以无菌风吹干后进行N+注入。离子注入在中国科学院等离子体物理研究所进行，N+能量为15keV，注入剂量为0(对照)～2.5×1015ions/cm2，真空度为10-3Pa。离子注入后，将经N+注入的培养皿和真空对照的培养皿分别用1mL无菌水洗脱，适当稀释后各取0.1mL涂布于PDA平板上，置32℃条件下倒置培养3～4d，用于单菌落的挑选和存活率的计算。

1.5 离子注入诱变效果的计算

1.5.1 存活率的计算

采用菌落计数法。分别统计真空对照组和离子注入组的菌落总数，按式(1)计算。

1.5.2 突变率的计算

挑取离子注入后的单菌落分别进行发酵实验，测试各菌株发酵混合糖的L-乳酸产量，以出发菌株作为对照，L-乳酸产量比出发菌株提高5%的视为正突变，降低5%的视为负突变，在±5%之间的视为未突变。根据L-乳酸产量分别计算正突变率、负突变率和总突变率。按式(2)、(3)、(4)计算。

1.6 检测方法

1.6.1 L-乳酸含量的测定

采用EDTA定钙法[12]。

1.6.2 发酵液中残糖的测定

采用DNS与HPLC相结合的方法。

DNS法：残糖以葡萄糖计。发酵液经8000r/min离心10min后，取上清液，采用DNS显色法[13]测定残糖的质量浓度。HPLC法：色谱仪型号为Waters e2695，色谱柱为Waters Carbohydrate Analysis Column(3.9mm× 300mm)，检测器为Waters 2424(ELS Detector)，进样量为10μL，流动相流速为1mL/min。流动相：75%乙腈-25%水；柱温30℃。

1.6.3 生物量的测定

采用菌体干质量法[13]。

1.7 实验设计

1.7.1 N+注入诱变利用混合糖发酵L-乳酸高产突变株的筛选

通过计算N+注入后各剂量下菌株的致死率和正突变率，确定N+注入该菌株的最佳诱变剂量。在该剂量下对菌株反复诱变，依次通过葡萄糖平板、木糖平板对菌株进行初筛，以获得既能利用葡萄糖又能利用木糖高产L-乳酸的米根霉菌株。将各菌落的变色圈与原始菌株的变色圈相比，挑选变色圈大的保藏在PDA斜面上，用于摇瓶复筛。对复筛获得的L-乳酸高产菌株进行遗传稳定性的研究。

1.7.2 高产菌株的培养基筛选

以玉米秸秆为例，其充分水解得到的混合糖中葡萄糖和木糖的质量比约为2:1[7-8,14]，因此本实验混合糖发酵培养基中葡糖糖和木糖以2:1的比例添加。分别对糖浓度、氮源种类、氮源浓度、磷酸盐种类、磷酸盐浓度、镁离子浓度、锌离子浓度各因素进行单因素试验筛选，以确定高产菌株利用混合糖发酵L-乳酸的适宜培养基组成。

2 结果与分析

2.1 N+注入筛选混合糖发酵L-乳酸的高产突变株

2.1.1 诱变剂量

对米根霉As3.819采用N+注入诱变，在15keV注入能量下，统计不同剂量的存活菌落数。以0剂量存活菌落数为对照，计算各注入剂量的存活率，绘制存活率曲线见图1。分别在不同剂量下挑取一定量的单菌落进行摇瓶发酵，测定L-乳酸产量，同时与出发菌株对照计算突变率，其结果见图2。

图1 N+注入对菌体存活率的影响Fig.1 Survival rate of Rhizopus oryzae As3.819 implanted with N+ ions

由图1可见，当N+注入剂量低于20×2.5×1013ions/cm2时，菌体的存活率随着注入剂量的增大而迅速降低；当剂量达到30×2.5×1013ions/cm2后，存活率有短暂的回升，并在50×2.5×1013ions/cm2时达到最大值；此后随着注入剂量的增加，菌体的存活率逐渐下降，整个过程呈“马鞍型”变化曲线。出现这种现象的原因可能是：低剂量的N+注入时，能量沉积效应和动量转移效应的综合作用，导致了DNA损伤和生物膜等大分子的损伤，造成了存活率的下降；中高剂量注入时存活率上升，可能是N+注入后电荷积累发挥了作用，激活了细胞的修复机制和修复酶；高剂量N+注入时，细胞损伤程度大于其修复能力，电荷效应也由于达到了临界值而产生库仑爆炸，保护屏障消失[15-17]。

图2显示，随着注入剂量的增加，菌株的突变率也随之增加；而正突变率则随着注入剂量的增加呈现先增大后减小的趋势，在50×2.5×1013ions/cm2时菌株的正突变率最高；超过此剂量后，虽然菌体的突变率继续增加，但正突变率呈下降趋势。另外，在该注入剂量下菌体的负突变率低于正突变率，表明以该剂量进行离子注入可获得较多的正突变株，有利于筛选工作的进行。

图2 N+注入对菌株突变率的影响Fig.2 Effect of implantation dose of N+ ions on positive, negative and total mutant rate of Rhizopus oryzae As3.819

综上所述，N+注入剂量在50×2.5×1013ions/cm2时，菌株的存活率为27.30%，且此剂量下菌株的正突变率最高。现代育种理论认为：被诱变微生物的致死率在75%左右即存活率在25%左右时产量性状的正突变率较高，当在更高的致死率下，虽然突变率可能较高，但是负突变往往很高，而正突变却很低[18]。实验结果与该理论基本相符。因此，本实验选择N+注入的诱变剂量为50×2.5×1013ions/cm2。

2.1.2 诱变筛选的高产菌株及遗传稳定性

采用最佳注入剂量50×2.5×1013ions/cm2对米根霉As3.819进行N+注入诱变处理，按照1.7.1节中所述的方法筛选高产菌株。将初筛获得的48株菌进行摇瓶发酵试验，测定L-乳酸产量，得到了3株高产突变株。此3株菌的L-乳酸产量均比原始菌株提高了10%以上，分别命名为N50-7、N50-13和N50-36。

为了确保筛选到的高产突变株的遗传稳定性，对以上实验中获得的3株高产菌株进行连续传代实验。各菌株每传一代重复3个摇瓶发酵测定L-乳酸产量，各代产量的平均值见表1。

表1 高产突变株的遗传稳定性Table 1 Genetic stability of three high-yield mutant strains

从表1可以看出，菌株N50-7的L-乳酸产量较高，且一直保持在79.40g/L左右，遗传特征稳定；而菌株N50-13开始的L-乳酸产量也比较高，但传6代后产酸性能有所改变，L-乳酸产量迅速下降；菌株N50-36虽然具有很好的遗传稳定性，但其L-乳酸产量较其他两个菌株低。因此，选择N50-7作为利用混合糖发酵生产L-乳酸的米根霉菌株进行进一步的研究。该菌株利用混合糖发酵L-乳酸的平均产量为79.42g/L，比出发菌株(67.45g/L)提高了17.75%。

2.2 高产菌株发酵的培养基筛选

2.2.1 种龄对发酵的影响

在L-乳酸发酵中选择适当的种龄非常重要，过老或太年轻的种子都会对发酵产生不利影响。太年轻的种子接种后使菌种前期的生长缓慢，发酵周期延长，产酸低。过老的种子虽然菌体量较多，但会出现菌体过早衰退的现象，最终导致产酸能力下降[19]。因此，首先根据1.2.3节方法绘制米根霉N50-7菌体生长曲线，其结果见图3。

图3 菌体生长曲线Fig.3 Growth curve of N50-7

由图3可知，该菌种在培养12h左右开始进入对数生长期，之后菌体数量迅速增加；24h后菌体数量趋于稳定，进入稳定期。可见，该菌株的对数生长期应在12～24h。考虑到一般选用种龄在菌体处于分裂旺盛的对数生长中后期的菌种为宜，选择了12～36h范围内7个时间点的种子液进行摇瓶发酵实验，其结果见图4。

图4 种龄对L-乳酸产量的影响Fig.4 Effect of seed age on L-lactic acid production

从图4可以看出，采用20～24h的种子液发酵，糖消耗的较完全，L-乳酸产量较高。而采用过早或过晚的种子，L-乳酸的产量都较低。因此采用培养20h的种子液接种发酵最好，后续实验均采用培养20h的种子液进行发酵实验。

2.2.2 混合糖质量浓度对L-乳酸产量的影响

葡萄糖与木糖按质量比2:1，选择不同的混合糖浓度进行发酵实验。在初始发酵培养基中添加混合糖质量浓度分别为90、120、150、180g/L，观察比较碳源浓度对L-乳酸产量的影响，结果见图5(残糖以葡萄糖计，计算转化率)。

图5 混合糖质量浓度对L-乳酸产量的影响Fig.5 Effect of total concentrations of glucose and xylose on L-lactic acid production

由图5可知，混合糖质量浓度在90～150g/L范围内，随着葡萄糖、木糖质量浓度的增加，L-乳酸的产量增加。当混合糖质量浓度为120g/L时，转化率最高，原料利用充分，但产酸量偏低；当混合糖浓度为150g/L时，产酸量最高，但转化率稍有下降；当混合糖质量浓度上升到180g/L时，产酸量有所下降且转化率明显减小。综合考虑，实验选用混合糖质量浓度为150g/L，其中葡萄糖100g/L，木糖50g/L。

2.2.3 氮源种类对L-乳酸产量的影响

选取NH4Cl、(NH4)2SO4、NH4NO3、尿素4种氮源，按照碳氮比180:1分别添加进行发酵实验，研究不同氮源对L-乳酸产量的影响，结果见图6。

图6 氮源种类对L-乳酸产量的影响Fig.6 Effect of nitrogen type on L-lactic acid production

由图6可知，(NH4)2SO4作为氮源的乳酸产量最高，NH4NO3次之。实验最终选用(NH4)2SO4作为培养基中的氮源。

2.2.4 硫酸铵质量浓度对L-乳酸产量的影响

分别添加1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0g/L的硫酸铵进行发酵实验，考察硫酸铵质量浓度对L-乳酸产量的影响，结果见图7。

图7 硫酸铵质量浓度对L-乳酸产量的影响Fig.7 Effect of (NH4)2SO4 concentration on L-lactic acid production

由图7可知，低质量浓度的(NH4)2SO4对发酵产L-乳酸有明显的促进作用，(NH4)2SO4质量浓度越高，L-乳酸产量越高。当培养基中(NH4)2SO4质量浓度高于3.0g/L后，L-乳酸产量减小，所以(NH4)2SO4质量浓度初步确定为3.0g/L。

2.2.5 磷酸盐种类对L-乳酸产量的影响

选择KH2PO4、NH4H2PO4、NaH2PO4、Ca3(PO4)24种磷酸盐作为此菌种磷元素的提供者进行发酵实验，结果见图8。

图8 磷酸盐种类对L-乳酸产量的影响Fig.8 Effect of phosphate type on L-lactic acid production

比较发酵结束后产酸量(图8)可知，KH2PO4作为磷酸盐优于其他几种磷酸盐。因此，实验最终选用KH2PO4作为培养基中的磷酸盐离子。

2.2.6 KH2PO4质量浓度对L-乳酸产量的影响

图9 KH2PO4质量浓度对L-乳酸产量的影响Fig.9 Effect of KH2PO4 concentration on L-lactic acid production

分别添加0.1、0.2、0.3、0.4、0.5g/L的KH2PO4进行发酵实验，考察KH2PO4质量浓度对L-乳酸产量的影响，结果见图9。

由图9可知，随着KH2PO4初始质量浓度增大到0.3g/L，L-乳酸产量都会随之增大。超过这个磷酸盐添加量，L-乳酸产量反而会有所降低。因此，确定添加KH2PO4的最佳初始浓度为0.3g/L。

2.2.7 MgSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O质量浓度对发酵产L-乳酸的影响

微生物在生长发酵过程中，需要磷、镁、硫、铁、钾、锌等元素作为酶的激活剂、生理活性物质的组成或生理活性作用的调节剂[19]。分别采用0.1～0.5g/L的MgSO4·7H2O和ZnSO4·7H2O进行摇瓶发酵实验，研究不同质量浓度的ZnSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O对L-乳酸产量的影响，结果见图10。

图10 MgSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O质量浓度对L-乳酸产量的影响Fig.10 Effects of MgSO4·7H2O and ZnSO4·7H2O concentrations on L-lactic acid production

由图10可知，当MgSO4·7H2O和ZnSO4·7H2O质量浓度分别为0.4g/L时，L-乳酸产量达到最大值；而质量浓度大于0.4g/L时，L-乳酸产量开始下降。分析其原因，应该是Mg2+和Zn2+在低质量浓度时，可以激活代谢途径中某些关键酶的活性，对细胞生长和产物合成有促进作用，而高质量浓度时则有抑制作用。考虑到MgSO4·7H2O在质量浓度为0.3～0.4g/L时，L-乳酸的产量相差甚微，从经济角度出发，最终选取MgSO4·7H2O质量浓度为0.3g/L，ZnSO4·7H2O质量浓度为0.4g/L。

2.3 高产菌株的发酵特性

将经N+注入筛选获得的利用混合糖发酵L-乳酸的高产菌株N50-7按照以上实验得到的培养基组分进行发酵培养，每隔6h取样检测绘制发酵曲线，其结果见图11。

乳酸发酵属于初级代谢过程，由图11可以看出，随着生物量的积累，L-乳酸产量迅速增长；葡萄糖从6h开始用于产酸，42h时剩余量已很少，继而木糖开始被大量利用，产酸量也有明显的提高。72h达到发酵终点时，L-乳酸的产量为103.81g/L，较培养基初筛前提高了30.71%。

图11 高产菌株发酵过程曲线Fig.11 Time courses of L-lactic acid production, glucose and xylose residues and cell biomass

3 结 论

本试验利用N+注入技术对L-乳酸生产菌株——米根霉As3.819进行诱变处理，经不同剂量的N+注入后，菌株的存活率呈典型的“马鞍型”曲线。在15keV、最佳注入剂量50×2.5×1013ions/cm2下，筛选得到1株具有良好遗传稳定性的高产突变株N50-7，其利用混合糖发酵L-乳酸的产量为79.42g/L，较出发菌株提高了17.75%。与此同时，对N50-7的发酵培养基进行了初步筛选，实验结果显示，在葡萄糖100g/L、木糖50g/L、(NH4)2SO43g/L、KH2PO40.3g/L、MgSO4·7H2O 0.3g/L、ZnSO4·7H2O 0.4g/L的条件下发酵72h，L-乳酸产量达到103.81g/L，较培养基初筛前提高了30.71%。本研究可为今后利用木质纤维原料生产L-乳酸提供参考，具有较好的社会效益及经济效益。

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Breeding of High-yield L-Lactic Acid Strains for Co-fermentation of Glucose and Xylose by N+Implantation

PANG Rui，PAN Li-jun*，JIANG Shao-tong，WU Xue-feng
(School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

In order to increase the production of L-lactic acid by co-fermentation of glucose and xylose, Rhizopus oryzae As3.819 was mutated by low energy N+ implantation. The results showed that the survival rate curve was a typical, , saddle shape , , with a high positive mutation rate at a dose of 50×2.5×1013ions/cm2. Under this implantation dose, strain N50-7 was obtained with high yield and stability. L-lactic acid yield by N50-7 was 79.42 g/L, 17.75% higher than the original strain. The optimal composition of fermentation medium for N50-7 were as follows: glucose 100 g/L, xylose 50 g/L, (NH4)2SO4 3 g/L, KH2PO4 0.3 g/L, MgSO4·7H2O 0.3 g/L and ZnSO4·7H2O 0.4 g/L. The final concentration of L-lactic acid was 103.81g/L after 72 h fermentation, which was 30.71% higher than that before breeding.

ion implantation；Rhizopus oryzae；mutation breeding；mixed sugars；L-lactic acid

Q815

A

1002-6630(2010)21-0248-06

2010-08-12

国家“863”计划项目(2007AA10Z361)；安徽省自然科学基金项目(090411015)

庞锐(1986—)，女，硕士研究生，研究方向为食品现代加工理论、方法及工程化技术。E-mail：pangrui2008_happy@126.com

*通信作者：潘丽军(1955—)，女，教授，博士，研究方向为农产品资源综合利用。E-mail：panlijun1955@163.com