翟丽芬,邓 琴

(1.嘉祥县环保局,山东嘉祥272400;2.东华大学环境科学与工程学院,上海201620)

金鱼组织中壬基酚的含量检测新方法探讨

翟丽芬1,邓 琴2

(1.嘉祥县环保局,山东嘉祥272400;2.东华大学环境科学与工程学院,上海201620)

建立一种直接检测环境中痕量壬基酚的外切酶保护-荧光定量PCR方法。首先向含雌激素受体及相关蛋白的细胞溶质中加入壬基酚-丙酮溶液,使受体蛋白活化,从而在体外与含雌激素反应位点的双链结合DNA作用形成壬基酚-雌激素受体-DNA复合物。复合物用核酸外切酶和S1核酸酶消解,去除未受到蛋白质保护的结合DNA。将消解后产物作为模板,进行荧光定量PCR扩增反应,建立壬基酚浓度与标准DNA拷贝数的对数之间的线性关系为:y(壬基酚浓度的对数)=11637x(标准DNA拷贝数的对数)-91505。该法检出限为10-8g/L,用该法对金鱼肝脏组织中壬基酚进行检测,添加回收率水平在9815%～11212%,变异系数在413%以下。

荧光定量PCR;壬基酚;核酸外切酶Ⅲ;检测

壬基酚(Nonylphenol,NP),分子式C15H24O,是一种人工合成的工农业上广泛应用的化合物[1]。壬基酚在工业中主要用于一种性能优异的表面活性剂—壬基酚聚氧乙烯醚(NPEOs)的合成。NPEOs本身毒性较小,没有明显的雌激素效应,但这类化合物在环境中不稳定,在污水处理厂的处理过程中,能够被降解生成NP。降解产物NP及其低分子聚合物的稳定性增加,水溶性降低,脂溶性增强,毒性也明显增加。NP的亲脂性较强,其辛醇-水分配系数为logkow=412～415[2],因此易于吸附在有机物和颗粒物表面上。在污水处理厂中大部分NP进入污水处理池的沉降泥渣中,残留的NP随出水排放到周围环境中,并成为纳污水域鱼类和其它水生生物的暴露源[3]。

目前NP对野生动物影响的研究大多集中于鱼类,因为鱼类对EDCs的作用比较敏感[4]。Ni mrod等发现鲶鱼体内雌激素受体水平的上升与NP暴露相关[5]。Purdom等人在英国一些污水处理厂出水口下游的河流中发现斜齿鳊鱼的雄性个体出现了雌性化特征,其活性物质最终被确定为壬基酚(NP)[6]。周忠良等研究NP对鲫鱼的雌激素效应发现,腹腔注射0101mg/kg的17β-雌二醇(E2)处理组和1100mg/kgNP处理组,鲫鱼血浆中卵黄蛋白原含量没有显著差异[7]。壬基酚的检测方法主要是色谱法[8]。但是用色谱法不仅昂贵费时,而且分析过程繁琐冗长。近年来,随着生物技术的发展产生了许多壬基酚的生物检测方法,如:免疫生物技术、芯片技术、酵母双杂交技术及慧星试验等。生物检测技术灵敏、快速、经济,特别适用于基层大量样本的筛选。生物检测中,PCR检测技术由于其灵敏度高,简单易行,受到了广泛关注。但PCR技术目前主要应用于检测壬基酚的雌激素效应[9,10],直接检测环境样本中壬基酚的含量的研究报导较少。

NP作为雌激素受体(Estrogen receptor,ER)的配体,能够与雌激素受体结合并能诱导雌激素受体介导的基因表达,其作用过程为:NP与细胞膜或细胞质中的雌激素受体结合,然后这种结合体迁移到细胞核并与核内DNA上的雌激素反应位点(estrogen responsive elements,EREs)结合,上行调节雌激素响应基因的转录和翻译,翻译产物蛋白质进入相应的靶组织或靶器官从而引起雌激素效应。根据此原理,本研究建立一种直接检测环境中痕量壬基酚的外切酶保护-荧光定量PCR方法。

1 材料与方法

1.1 试剂

主要试剂包括壬基酚(日本东京化成工业株式会社),核酸外切酶Ⅲ(fer mentas公司),S1 nucle2 ase(fer mentas公司),PCR试剂盒(博大泰克公司),PCR纯化试剂盒(博大泰克公司),SY BR Green I PCR mix(上海闪晶生物科技有限公司),试验所用其它试剂均为国药集团化学试剂有限公司生产。

1.2 分析仪器

主要试验用仪器包括UV-2000紫外分光光度计;梯度PCR仪;rotor-gene 3000荧光定量PCR仪;DYY-11型电泳仪(北京市六一仪器厂);Tanon-2500R数码凝胶图像处理系统(上海天能科技有限公司);旋转蒸发仪;pH SJ-4A实验室pH计(上海精科)。

1.3 动物

实验用金鱼购自上海松江菜花泾农贸市场,全长615±015cm(平均值 ±标准差),体重718±115g。在去氯自来水中驯养7d后,投壬基酚-丙酮溶液使鱼缸中水的壬基酚暴露浓度为0101mg/L。实验过程中采用静态换液,每24h更换1次。喂养30d。

1.4 试验方法

1.411 含EREs的双链DNA的制备

将pUC19质粒稀释50倍作为模板,用设计合成的含有雌激素反应位点的上下游引物[11],通过常规PCR方法扩增,制得双链DNA。引物序列分别如下:上游引物:5′CGGAG TTCCG TGAGA AGAGG ATAAC GCAGG AAAGA ACATG 3′;下游引物:5′CTCTT CTCAC GCAAC TCCGG TCAGG CAACT ATGGA TGAAC 3′。PCR产物是一条924 bp双链DNA,5′和3′端各含一个EREs。于1%低熔点琼脂糖凝胶电泳分离,PCR产物快速纯化试剂盒纯化回收。用紫外分光光度法测回收DNA的浓度并检测回收效果。将DNA浓度转换为拷贝数,然后用灭菌双蒸水对回收DNA进行10倍稀释,用于定量标准曲线的建立。

1.412 标准曲线的建立

以上述稀释后不同拷贝数的结合DNA作为模板,各取215μl,加入SYBR Green I Master mix 10μl(MgCl2最佳浓度为2μmol/L),上下游引物(10μmol/L)各1μl,灭菌双蒸水515μl。荧光定量PCR循环步骤:94℃预变性5min,94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸1min,循环40次。最后在72℃延伸5min。

1.413 活化雌激素受体

取暴露驯养的金鱼,用5mg/L的苯佐卡因麻醉。取出鱼肝脏,用0115mol/L冰上预冷的氯化钾溶液洗去肝脏外血液,称重,按m(肝脏)∶v(缓冲液)=1∶4的比例加入HEDG缓冲液(冰上预冷)于玻璃匀浆器中匀浆。匀浆液于12000g离心20min,收集上清。再于16000g离心1h,小心吸取上清,即为含有雌激素受体的细胞溶质[12]。用Bradford法测定蛋白浓度[13]。将1g/L的壬基酚按10倍比稀释为011g/L～1ng/L,各取10μl,加入上述提取的细胞溶质250μl,于20℃振荡温育2h。

1.414 壬基酚、雌激素受体、DNA的结合反应与酶切保护处理

从上述不同浓度壬基酚与含雌激素受体的细胞溶质结合形成的受体-配体复合物中,每管取出20μl于115ml EP管中,加入1μg的poly(di1dc)于20℃温育15min后,再加入2μl未经稀释的回收DNA,继续20℃温育15min,此时溶液中为壬基酚、雌激素受体、结合DNA的复合物,即受体-配体-结合DNA复合物。

酶切步骤:从上述受体-配体-DNA复合物中各取12μl于灭菌后115ml EP管中,按6∶1∶1的比例加入ExoⅢbuffer、HEDG缓冲液,使总体积为20μl,混匀后37℃温育15min。再每管加入ExoⅢ100U,混匀后于37℃温育15min。按照1∶3的比例,加入S1(2U/μl)混合液,37℃温育30min。再各加入4μl S1停止液(013mol/L Tris碱,1135mol/L EDTA),70℃灭活10min。得到荧光定量PCR的模板。

1.415 不同浓度壬基酚诱导结合DNA的定量PCR测定

以受体-配体-结合DNA复合物酶切产物作为模板,按照标准曲线建立方法进行PCR扩增,绘制壬基酚浓度相对应双链结合DNA拷贝数的曲线图。结合标准曲线,建立壬基酚浓度-Ct值关系曲线,从而建立检测壬基酚FQ-PCR方法。参考文献,提取金鱼鱼肉组织,用FQ-PCR检测金鱼体内壬基酚残留含量。

2 结果与分析

2.1 定量标准曲线的建立

SYBR Green I荧光定量PCR是近年来出现的具有高灵敏度的定量PCR方法,它是在常规PCR基础上加入了SYBR Green I染料,此染料可与双链DNA结合,发出荧光信号,且荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。当荧光信号达到一定阈值时,循环次数(Ct值)被记录下来,Ct值和初始模板量的对数值有严格的线性关系,从而达到定量的目的。

通过常规PCR扩增制备含EREs的双链DNA,纯化回收后,用紫外分光光度法测得OD260/OD280比值为1176,说明回收DNA纯度高,无污染。OD260值为01208,计算得DNA浓度为10μg/ml。一个质粒质量MW=924bp323330=609840g,一个质粒(拷贝数)的质量:609840/6103310-23=110125310-9ng=1310-9ng,从而回收DNA为1010copies/μl。然后用灭菌双蒸水进行10倍稀释,梯度为108～103copies/μl,进行荧光定量PCR扩增,扩增曲线如图1所示。为了确定荧光定量PCR体系的重复性,每个浓度各设立两个对照组。用Ct值与其对应的不同定量模板的对数拟合作图,其中横坐标代表不同定量模板起始拷贝数,纵坐标代表Ct值,得出一条定量标准曲线,如图2所示,在103～108copies/μl范围内,Ct值与起始模板浓度的对数之间有很好的线性关系。两者关系式为y(Ct)=-31008x(模板初始拷贝值的对数)+281855,相关系数R2=0199120。模板拷贝数每增加10倍,Ct减小3～4,变化幅度足以区分两个不同浓度的模板。PCR扩增效率为1115。

2.2 蛋白质浓度测定的标准曲线

蛋白质浓度测定的标准曲线见图3,将在波长为595 nm处测定的吸光度代入解析式即可得到相应蛋白质浓度。

将提取的鱼肝细胞质溶液稀释10倍后取1ml与5ml考马斯亮蓝试剂混合,各管摇匀后放置2 min,用分光光度计测定595 nm处的吸光值,测得吸光度值分别为01500。代入标准曲线方程计算得到蛋白质溶液浓度,根据稀释倍数换算,壬基酚暴露后,提取的金鱼肝脏细胞溶质中蛋白质浓度为85813μg/ml。按20(蛋白质质量)∶1(壬基酚溶液体积)的比例进行受体-配体复合。

2.3 壬基酚剂量-效应曲线

以不同浓度壬基酚诱导的受体-配体-结合DNA复合物作为模板,按照标准曲线建立方法进行PCR扩增,扩增结果如表1所示。Ct值随着复合物中加入壬基酚浓度的增加而减少,在10-8～10-2g/L浓度范围内,壬基酚浓度每增加10倍,Ct减小3～4。丙酮处理组与PCR阴性对照组都没有检测到荧光信号。结果表明荧光定量PCR可以用于检测不同浓度壬基酚诱导产生的结合DNA量。将高于设定的基线阈值3倍的标准差的荧光信号设为阳性,即阳性信号≥基线阈值+33SD,根据这个标准确定该方法对壬基酚最低检测线为10-8g/L。

表1 不同浓度壬基酚诱导结合DNA的PCR扩增结果

结合标准曲线方程,得到壬基酚浓度与标准DNA拷贝数之间的线性关系,如图4。

经回归分析,得到壬基酚浓度与标准DNA拷贝数的对数之间的线性关系。两者线性关系式为:y(壬基酚浓度的对数)=11637x(标准DNA拷贝数的对数)-91505。通过求荧光定量PCR所测的结合DNA的量,就可以求知壬基酚的量。

2.4 精密度、准确度试验及回收率计算

取一条金鱼的肝肾等组织,滤纸吸干水分后称重,加入2ml甲醇研磨,研磨后转移到分液漏斗中,用1ml甲醇冲洗研磨钵,冲洗后液体也转移到分液漏斗中。加入5ml正己烷∶乙醚(7∶3)萃取液萃取3次后,用旋转蒸发仪浓缩蒸干,最后加入丙酮定容为2ml,按上述受体-配体-DNA复合步骤进行试验,用建立的外切酶保护-PCR测得预处理后NP浓度为10μg/L,对应鱼肝脏中壬基酚的含量为24μg/kg。加入壬基酚标准溶液,添加浓度分别为1μg/L、2μg/L、5μg/L,计算相对偏差和回收率,结果见表2。回收率范围在9815%～11212%,RSD在216%～413%,均满足分析要求。

表2 金鱼肝脏中壬基酚的检测及加标回收

3 结论

(1)利用荧光定量PCR技术直接检测环境样本中壬基酚的含量,未见文献报道。

(2)建立了一种新的直接检测壬基酚的酶切保护-荧光定量PCR检测方法。含雌激素反应位点的双链DNA与被壬基酚活化的雌激素受体结合,作为荧光定量PCR的模板。在PCR的基础上引入外切酶保护,与雌激素受体结合的DNA受到蛋白质的保护,不被核酸外切酶降解,而未受到保护的双链DNA被降解为单链。在基础上利用S1酶完全切除核酸外切酶Exo III酶切后留下的单链,使游离DNA完全不能被PCR扩增出,大大降低了假阳性率,提高了灵敏度。

(3)该方法建立了壬基酚浓度与标准DNA拷贝数的对数之间的线性关系为:y(壬基酚浓度的对数)=11637x(标准DNA拷贝数的对数)-91505。检出限为10-8g/L,加标回收率范围在9815%～11212%,RSD在216%～413%,均满足分析要求。

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Research on a New FQ-PCR Assay for Detection of Nonylphenol in Goldfish

ZHA ILi2fen1,DENGQin2
(1.Jiaxiang Environmental Protection Bureau of Shandong Province,Jiaxiang Shandong 272400 China)

This study aims to establish an Exonuclease Protection2fluorescence quantitative PCR assay for directly detection of the trace nonylphenol in environment.Estrogen receptor can be activated by nonylphenol so as to com2 bine with a double2stranded DNA which contains estrogen responsive elements.By combined with estrogen recep2 tor,this double2stranded DNA was protected by protein so that it can retain after the digestion of the exonucleaseⅢ.This trace retained DNA could be amplified by FQ2PCR.According to this theory,this research will first add nonylphenol2acetone to solute which contains estrogen receptor and associated protein,and combined to double2 strand DNA with estrogen responsive elements in vitro to format the nonylphenol2estrogen receptor2DNA complex.Then these complexeswere digested by the exonuclease and S1 nuclease to remove the DNA which is not protected by protein.After the digestion,the complexes can be used as a template for FQ2PCR amplification.The relation2 ship bet ween the logarithm of the concentration nonylphenol and the standard DNA copy number was established,linear equation is:y=116455x-91523.This assaywas applied to detect nonylphenol in goldfish,the average re2 coveries prove to be between 78%-93%and the coefficient variation under 413%.

PCR;nonylphenol;exonucleaseⅢ;detection

X83

A

1673-9655(2010)05-0001-05

2009-06-21

上海市基础研究重点项目(09JC1400600)。