杨 敏，杨树科，王 炯，杨 伟，王红斌*

(云南民族大学化学与生物技术学院，云南 昆明 650031)

离子色谱法测定白菜中的硝酸盐、亚硝酸盐、磷酸盐及总磷、总氮

杨 敏，杨树科，王 炯，杨 伟，王红斌*

(云南民族大学化学与生物技术学院，云南 昆明 650031)

以白菜为例建立超声辅助提取(UAE)离子色谱法(IC)测定蔬菜中硝酸盐、亚硝酸盐、磷酸盐、总氮、总磷含量的方法，并对白菜各部位的硝酸盐、亚硝酸盐及磷酸盐含量的分布进行研究。结果表明：当进样量为20 μL，使用Na2CO3-NaHCO3为淋洗液，NO2－、NO3－、PO43－、总氮(TN)、总磷(TP)的最小检出限分别为0.015、0.014、0.030、0.014、0.061mg/L，相关系数为0.9990～0.9999，RSD为0.22%～0.94%，回收率为80.0%～110.0%。该法简便快速、精密度和准确度高，15min就可完成白菜中硝酸盐与亚硝盐、磷酸盐含量的分析。

离子色谱；超声；白菜；氮；磷

Abstract：Chinese cabbage was used as the sample to establish a method for determining nitrate, nitrite, phosphate, total phosphorus (TP) and total nitrogen (TN) through ultrasound-assisted extraction and ion chromatography (UAE-IC). The distribution of these compounds in different parts of Chinese cabbage was also investigated. The detection limits for nitrate,nitrite, phosphate, TP and TN were 0.015, 0.014, 0.030, 0.014 mg/L and 0.061 mg/L, respectively, at a sample injection volume of 20 μL using an elution system composed of Na2CO3 and NaHCO3. The determination coefficients of the developed linear equations of these analytes and the precision relative standard deviations (RSDs) were in the range of 0.9990 to 0.9999 and 0.22% to 0.94%. The spike recovery rates of these analytes were between 80.0% and 110.0%. This method is characteristic of simple operation, fast detection, and accurate and reliable results.

Key words：ion chromatography；ultrasound；Chinese cabbage；nitrogen；phosphorus

近年来，蔬菜的安全性问题备受人们关注，我国已对无公害蔬菜中亚硝酸盐和硝酸盐含量作了限量标准[1]：叶菜类亚硝酸盐≤4.0mg/kg、硝酸盐≤3000mg/kg。蔬菜是人体硝酸盐的主要来源，人体摄入的硝酸盐有70%～80%来自蔬菜[2]，在正常情况下，蔬菜从土壤中吸收的硝酸盐在体内经硝酸还原酶的作用，转化为氨和氨基酸等营养物质[3]。此外，在体内细菌的作用下硝酸盐可还原成亚硝酸盐，亚硝酸盐可与仲胺、叔胺、酰胺及氨基酸结合，形成亚硝胺，亚硝酸盐可使血液的载氧能力下降，导致高铁血红蛋白症；亚硝胺会诱发消化系统癌变。因此，对蔬菜中无机盐的控制，是当前国内外的重要研究课题。

超声辅助萃取(ultrasonic-assisted extraction，UAE)是利用空化效应、热效应、机械搅拌、强化扩散、乳化作用、凝聚作用等理化特性对目标产物进行提取，具有快速、常温、能耗低、提取率高等优点[4]而越来越受到人们的重视。本实验利用梅花布点法对白菜进行采样，超声提取，SPE-C18小柱净化，离子色谱法分析白菜中的硝酸盐、亚硝酸盐、磷酸盐、总氮(TN)、总磷(TP)，旨在为白菜中氮、磷的测定提供方法学参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

新鲜白菜 昆明市呈贡县郎家营农贸市场。

KNO3、KNO2、KH2PO4、Na2HPO4(均为优级纯)；K2S2O8、NaOH(均为分析纯)。

标准贮备液(1000mg/L)：硝酸盐、亚硝酸盐、磷酸盐、总磷磷酸盐(Na2HPO4)等溶液用超纯水配制，于4℃条件下保存；氧化液：0.074mol/L过硫酸钾和0.075mol/L氢氧化钠混合溶液[5]。使用时用超纯水稀释至所需浓度，配制不同浓度的混合标准溶液。

ICS-1500型离子色谱仪、DS6温控电导检测器、IonPac AS14(250mm×4.0mm)离子交换柱、IonPac AG14(50mm×4.0mm)保护柱、ASRS-300自动再生抑制器、chromeleon工作站(软件带空白扣除) 美国戴安公司；AS10200AD超声波清洗机 天津奥特赛恩斯仪器有限公司；0.45μm微孔过滤器、SPE-C18固相萃取小柱、尼龙0.22μm微孔滤膜 天津富集科技有限公司。

1.2 色谱条件

仪器平衡时间为10～15min；柱温为30℃；定量进样环为20μL；淋洗液为3.5mmol/L Na2CO3+1.0mmol/L NaHCO3；抑制器电流为24mA；流速为1.2mL/min，以峰面积定量。

采动应力对巷道底板的变形量影响很大，五阳矿76采区2号专用回风巷在相邻工作面开采超前支承应力的作用下，巷道底板载荷急剧增加。取巷道宽度b=5.0 m，埋深H=560 m，P为1.5γH，得出五阳采区2号专用回风巷底鼓破坏满足上述条件④，说明其底板会发生如图5d所示的破坏形式，即全断面挤压流动底鼓。

1.3 样品前处理

1.3.1 样品的提取(硝酸盐、亚硝酸盐、磷酸盐)

取新鲜白菜样品，用自来水洗净后用蒸馏水冲洗，再用超纯水冲洗，晾干。准确称取20.00g样品放于研钵中，研磨至匀浆，然后加入适量超纯水(控制在90mL以下)，制成匀浆系统，超声波提取0～30min后，0.45μm滤膜过滤，取全部滤液定容于100mL容量瓶中。样品取主体浓度(中间部分)10mL于50mL容量瓶中稀释定容，待去除干扰物。

1.3.2 TN、TP的提取[6-7]

取上述采样的白菜，经清洗、晾干后，四分法取样20.00g，研磨、超声提取后，加入氧化液2.5mL，同时以试剂空白作参比，密封后放入高压蒸汽消毒器中，加热至120℃时维持30min，取出冷却至室温，0.45μm滤膜过滤，取滤液定容于100mL容量瓶中，从中取10mL溶液于50mL容量瓶中稀释定容，待去除干扰物。

1.3.3 样品的净化

蔬菜汁中含有许多大分子有机物、色素和一些影响待测离子出峰的无机离子，不仅会污染分离柱，还会缩短柱的使用寿命，降低灵敏度。SPE-C18固相萃取小柱不含阴、阳离子交换位点，能强保留疏水性物质。因此，用经活化(甲醇)的SPE-C18小柱净化样品，弃去前10mL，收集后2mL样品溶液经0.22μm滤膜过滤，测定。

1.4 测定方法

采用标准曲线法测定[8]。分别用标准储备液配混合标准系列，以质量浓度对电导响应值做线性回归进行定量计算。

2 结果与分析

2.1 样品离子色谱图

亚硝酸盐、硝酸盐、磷酸盐的三元标准样品色谱图见图1。由图1(a)、2(a)可知，标准品的基线平稳、峰形对称、分离效果好。蔬菜中基体组成复杂，干扰物质多，会使出峰时间延迟，峰拖尾，变形，由图1(b)、2(b)可见，用本实验的样品前处理方法和色谱条件，各离子都得到了较好的分离。比较图1、2可知，用碳酸钠、碳酸氢钠(pH=9.5±2)为淋洗液体系，TP的定性和定量以计，保留时间均为10.5min。

图1 离子色谱图Fig.1 Ion chromatogram of nitrate, nitrite and phosphate

图2 TN、TP离子色谱图Fig.2 Ion chromatogram of total phosphorus and total nitrogen

2.2 线性范围、精密度和检出限

依上述1.2节色谱条件，待测各离子的线性范围、精密度(RSD)、回归方程、相关系数见表1。

表1 5种物质的线性范围、精密度、回归方程、相关系数Table 1 Linear range, precision, regression equation and correlation coefficient of five materials

表2 回收率实验结果(n=6)Table 2 Results of recovery experiments (n=6)%

2.3 加标回收率实验[9-15]

同时进行所有样品的制备，向其中一份菜茎(总共2份)中加入混标标准，使成为0.50、0.70、0.90mg/kg 3个质量浓度梯度，每个梯度6个平行样品，经前处理过柱净化后测其加标回收率，结果如表2所示。

由回收率统计结果可知：使用超声提取，C18小柱净化测定蔬菜中的氮和磷，不仅提取速度快，而且加标回收率都在80%～110%之间，说明该方法准确度较好。

2.4 提取条件的优化

蔬菜中的无机阴离子易溶于水形成离子态，连续性超声水提在实验过程中无污染、提取速度快，使用IonPac AS14色谱分离柱易实现前处理和分离。按文献[16-17]报道的方法，对显著性影响因素超声时间进行优化选择。

取蔬菜样品，分别在0、10、15、20、25、30min时间段里用菜茎进行超声实验。

图3 硝酸盐超声辅助萃取曲线Fig.3 UAE curve of nitrate

图4 亚硝酸盐超声辅助萃取曲线Fig.4 UAE curve of nitrite

图5 磷酸盐超声辅助萃取曲线Fig.5 UAE curve of phosphate

从图3～5可以看出，超声时间在20min内，硝酸盐、亚硝酸盐和磷酸盐随萃取时间增加萃取量增加，20min后萃取量基本不再增加，本实验选择萃取时间25min。

2.5 样品稳定性实验

取经前处理好的腐叶，分别保存0、2、4、6、10、12h后进行IC测定，其含量变化如图6～8所示。

由图6可知，储备后，硝酸盐含量在0～2h下降，2～4h微升，4～10h上升稍快，10～12h下降。而图7中亚硝酸盐含量的变化基本与之相反，这说明在微生物的作用下，硝酸盐被还原成亚硝酸盐[18]。图8中磷酸盐样品在0～4h含量逐渐减少，4～9h上升，9～12h含量无变化，但高于现测的水平。

图6 硝酸盐稳定性曲线Fig.6 Stability curve of nitrate

图7 亚硝酸盐稳定性曲线Fig.7 Stability curve of nitrite

图8 磷酸盐稳定性曲线Fig.8 Stability curve of phosphate

2.6 样品的测定

2.6.1 不同部位样品的测定

表3 样品中不同部位含量的测定Table 3 Contents of nitrate, nitrite and phosphate in different parts of Chinese cabbage mg/kg

由表3可知，除了腐叶中亚硝酸盐含量超标[1]，正常可食部分中，硝酸盐集中在菜茎、亚硝酸盐集中在菜叶，磷酸盐集中在菜根。

取不同部位的样品四分法取样进行TN、TP测定，TN含量为509.95mg/kg，TP含量为1080mg/kg。

2.6.2 15个样品的测定

用梅花布点法[19]和随机取样法分别采集昆明市呈贡县郎家营菜地和农贸市场15个样品，在优化条件下用相同的样品前处理方法和色谱条件测定，结果见表4。

表4 15个样品含量的测定Table 4 Contents of nitrate, nitrite, phosphate, TP and TN in 15 samples mg/kg

待测样品中的硝酸盐、亚硝酸盐、磷酸盐经超声提取后，溶于水相，以形式存在，经IC分析可知：15个样品中除农贸市场样品的亚硝酸盐含量大于国家限量标准(4.0mg/kg)外，其他样品均低于限量标准，总体平均值在3.78mg/kg。硝酸盐含量均低于国家标准限量(3000mg/kg)。磷酸根是人体合成细胞壁的基础物质，蔬菜中的磷酸盐安全、无毒，对人体有补钙、补铁、补锌等作用，是人体从食物中获取的主要途径。

3 结 论

本实验用UAE-IC法对白菜中的硝酸盐、亚硝酸盐、磷酸盐、TN、TP进行了分析测定研究，在样品的预处理过程中，选择了适宜的前处理、提取、净化方法，避免了不必要的待测组分流失。在样品测定过程中，选择了合适的稀释倍数、淋洗液及浓度、流量，获得了较好的分离效果。相关系数和回收率都很好。表明了该检测方法简便易行、结果可靠、适用于大批量进样。可为其他植物中无机阴离子的快速检测提供参考。

[1] GB 18406—2001 农产品安全质量无公害蔬菜安全要求[S].

[2] 宾士友, 阮月燕, 蔡耕鸣. 广西蔬菜水果硝酸盐含量状况与控制措施[J]. 广西农学报, 2006, 21(1):23-25.

[3] 贾丽. 蔬菜中硝酸盐和亚硝酸盐的分析[C]. 杭州:第十一届全国离子色谱学术报告会论文集, 2006:31-34.

[4] 周斌. 用超声波提取中药材[J]. 安徽科技, 2005(4):23-24.

[5] 李联盟, 徐惠民. 碱性过硫酸钾氧化:离子色谱法测定地面水、废水中的总氮总磷[J]. 中国环境监测, 1987, 3(1):116-119.

[6] 杨妍. 离子色谱法测定水中总氮[J]. 化学分析计量, 2006, 14(2):54-55.

[7] 李宝光, 何敬峰, 马明建, 等. 离子色谱法测定水体中总氮的含量[J].淄博学院学报, 2002, 4(3):54-56.

[8] 符继红, 解成喜, 张丽静. 离子色谱法测定麻黄中的无机阴离子[J].色谱, 2004, 22(1):72-73.

[9] 李月欢, 黄丽. 过硫酸钾氧化:离子色谱法测定废水中总氮[J]. 检验技术, 2005, 31(4):48-49.

[10] 张吉祥, 周建科, 吴志勇. 离子色谱法测定柿叶中有机酸和无机阴离子[J]. 理化检验:化学分册, 2002, 38(1):29-32.

[11] 张胜利, 魏永宁. 离子色谱法测定银杏叶中无机阴离子[J]. 理化检验:化学分册, 2008, 44(2):166-170.

[12] 胡静, 曹顺安. 分析有机酸与无机阴离子的梯度离子色谱法[J]. 分析测试学报, 2003(4):83-85.

[13] 张新智. 离子色谱法同时测定苹果汁中的亚硝酸盐、硝酸盐和硫酸盐[J]. 检验检疫科学, 2008(1):32-34.

[14] 康勤书, 周永强, 陈浩. K2S2O8-离子色谱法测定水中总氮量[J]. 分析试验室, 2008, 27(5):112-114.

[15] 钟志雄, 李攻科. 离子色谱法测定海产品中磷酸盐、焦磷酸盐、偏磷酸盐和总磷[J]. 色谱, 2009, 27(4):499-504.

[16] 刘振春, 邓子瑜, 李慧, 等. 超声波辅助酶法水解玉米蛋白的工艺研究[J]. 食品科学, 2009, 30(12):61-65.

[17] 尚军, 李来好, 吴燕燕, 等. 响应面法优化超声波辅助蛋白酶水解合浦珠母贝肉的条件研究[J]. 食品科学, 2009, 30(18):44-49.

[18] 刘佳. 微生物好氧硝酸盐还原产铵研究[D]. 成都:四川大学, 2007.

[19] 奚旦立, 孙裕生, 刘秀英. 环境监测[M]. 3版. 北京:高等教育出版社, 2004:269-272.

Determination of Nitrate, Nitrite, Phosphate, Total Phosphorus and Total Nitrogen in Vegetables Using Ion Chromatography

YANG Min，YANG Shu-ke，WANG Jiong，YANG Wei，WANG Hong-bin*
(School of Chemistry and Biotechnology, Yunnan University of Nationalities, Kunming 650031, China)

O611.5

A

1002-6630(2010)18-0216-04

2009-12-31

国家自然科学基金项目(60963026)；云南省社会发展科技(应用基础研究)项目(2009CD100)；云南民族大学大学生创新型实验计划项目(2010HSCX01)

杨敏(1966—)，女，教授，硕士，研究方向为色谱分离分析。E-mail：yangm4849@tom.com

*通信作者：王红斌(1966—)，男，教授，硕士，研究方向为分离分析技术及应用。E-mail：wanghb2152@tom.com