李从军，谢爱娣

(1.湖北生物科技职业学院，湖北 武汉 430070；2.湖北工业大学工程技术学院，湖北 武汉 430068)

离子交换树脂分离谷胱甘肽洗脱液的脱盐研究

李从军1，谢爱娣2

(1.湖北生物科技职业学院，湖北 武汉 430070；2.湖北工业大学工程技术学院，湖北 武汉 430068)

为提高离子交换树脂法分离纯化谷胱甘肽的产品质量，采用大孔吸附树脂SP-207对732强酸性离子交换树脂分离酵母提取液中谷胱甘肽的洗脱液进行脱盐效果研究。在优化的条件下，脱盐率达到99.86%、谷胱甘肽回收率65.71%，说明大孔树脂SP-207用于脱盐效果非常理想。

谷胱甘肽；脱盐；大孔吸附树脂

Abstract：To improve the quality of glutathione purified with 732 type ion-exchange resin column, SP-207 type macroporous adsorption resin was used to desalinate the pooled glutathione-containing eluate. Under optimized conditions, the desalinization ratio was 99.86% and the recovery rate of glutathione was 65.71%. SP-207 type macroporous resin adsorption is a good choice for desalination.

Key words：glutathione；desalination；macroporous adsorption resin

还原型谷胱甘肽(GSH)是一种广泛存在于动、植物和微生物细胞中的具有重要生理功能的活性三肽[1]。谷胱甘肽作为细胞内唯一的含巯基的三肽在细胞生物学中发挥着非常关键的作用[2]，在食品工业、医药临床和运动营养学得到广泛的应用。目前谷胱甘肽的生产方法主要有萃取法、发酵法、酶法和化学合成法[3]。由于微生物发酵法与其他方法相比具有明显的优越性，是今后生产谷胱甘肽的主要趋势，也是目前为止最具潜力的方法。目前报道的分离纯化谷胱甘肽的方法主要有铜盐法、树脂法、电渗析法和双水相法4种[4-7]。树脂法相对其他方法经济效益较高，也是国外广泛采用的方法。其中，离子交换树脂法已有多篇专利和文献报道[5,8-11]。但是，由于酵母提取液本身含有一些盐分，且离子交换树脂分离谷胱甘肽一般采取增强离子强度洗脱，洗脱液中也将会含有大量的盐，为后续处理带来麻烦、影响产品质量，所以必须进行脱盐处理。大孔吸附树脂是一类不同于离子交换树脂的吸附和筛选性能相结合的分离材料，它是分离有机化合物尤其是水溶性化合物的有效手段。对有机物的选择性良好，无机盐的存在非但不干扰吸附反而有利于吸附[12]。本实验采用大孔吸附树脂对离子交换洗脱液进行脱盐，研究其脱盐条件。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

啤酒酵母 由本实验室保藏。

培养基和培养条件：葡萄糖50g/L、酵母粉5g/L、KH2PO42g/L、MgSO41g/L、pH值自然。121℃灭菌30min，培养温度25～28℃，摇床转速150～180r/min。

732强酸性阳离子交换树脂 安徽三星树脂科技有限公司；大孔吸附树脂SP-207 日本三菱化学公司。

GSH标准品(纯度≥98%) Sigma公司；硝酸银、铬酸钾、5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(简称DTNB)、亚硝基铁氰化钠、Tris、甲醇、盐酸、氢氧化钠(均为国产分析纯)。

1.2 仪器与设备

BSZ-100自动部分收集器、HL-2恒流泵、层析柱(φ2.6cm×20cm) 上海沪西分析仪器厂；UNICO UV-2100紫外-可见分光光度计 上海尤尼卡公司；恒温水浴锅 上海医疗器械五厂；控温摇床 中国科学院武汉科学仪器厂；微量移液枪 美国热电公司；Anke TGL-16G高速冷冻离心机 上海飞鸽公司；Mettler AE100分析天平 Mettler公司。

1.3 方法

1.3.1 测定方法

谷胱甘肽：采用DTNB法测定[13]；盐浓度测定方法：以Cl－浓度表示，采用莫尔法测定[14]；洗脱终点判断：采用亚硝基铁氰化钠检测法[15]，观察其颜色变化，若颜色变为红色，表明洗脱液中有还原型谷胱甘肽存在，否则，表明洗脱液中无还原型谷胱甘肽存在。

1.3.2 树脂预处理方法

732强酸性阳离子交换树脂：取一定量的树脂，用自来水反洗除去机械杂质(约3～5次)，用一定浓度的NaOH溶液洗出杂质(约泡2h)，用去离子水洗至中性，再用一定浓度的HC1溶液转型(约浸泡2h)，再用去离子水洗至中性，抽滤，置于具塞试剂瓶中，待用。

大孔吸附树脂SP-207：通过乙醇(或甲醇)与水交替反复洗脱，可除去树脂中的残留物，一般洗脱剂用量为树脂体积的2～3倍，交替洗脱2～3次，最终以水洗脱，保持分离使用前的状态。使用甲醇、丙酮、或酸碱、水的反复再生处理，即可恢复树脂的吸附能力。

2 结果与分析

2.1 离子交换洗脱液制备

2.1.1 含谷胱甘肽酵母提取液制备

由斜面挑取一环菌种接种于装液量30mL的锥形瓶，28℃、200r/min培养2d后接种于装液量500mL锥形瓶，相同条件培养4d后收获菌体。采用热水抽提法[16]进行提取，得含谷胱甘肽的酵母提取液。

2.1.2 离子交换分离谷胱甘肽洗脱液的制备

80g树脂装入φ2.6cm×20cm层析柱，800mL酵母提取液(谷胱甘肽含量342.21mg/L)用盐酸调pH3.0左右，以0.5柱床体积/小时(BV/h)上柱吸附再以1BV水洗柱然后用1.0mol/L盐酸1.0BV/h洗脱，至采用亚硝基铁氰化钠检测法颜色变为无色，洗脱达到终点。洗脱液用氢氧化钠中和至pH2.0～3.0。

2.2 大孔吸附树脂SP-207脱盐研究

2.2.1 盐(NaCl)存在对谷胱甘肽吸附的影响

取树脂各2g，分别加入pH2.0的400mg/L谷胱甘肽标准溶液10mL，向其中加入不同质量的NaCl固体，吸附3h后，测定上清液中谷胱甘肽含量和Cl－含量，分别计算GSH和NaCl吸附量。对表1数据采用SPSS软件进行差异显著性分析，经t检验，不同NaCl质量浓度下所测结果差异不显著(P＞0.05，n=5)，说明谷胱甘肽样品中不同质量浓度盐(NaCl)的存在不影响大孔吸附树脂对谷胱甘肽的吸附，大孔吸附树脂对盐基本没有吸附作用，故可以考虑用大孔树脂脱除离子交换树脂洗脱液中的盐。

表1 NaCl溶液质量浓度对SP-207吸附谷胱甘肽的影响Table 1 Effect of NaCl concentration on glutathione adsorption on SP-207 type macroporous adsorption resin

2.2.2 盐存在下的动态吸附曲线

80g树脂装入φ2.6cm×20cm层析柱，600mL谷胱甘肽标准溶液(谷胱甘肽含量400mg/L，NaCl溶液浓度1.5mol/L，pH2.0)以0.5BV上柱吸附然后用自动部分收集器收集(10mL/管)，吸附曲线如图1所示。

图1 NaCl存在下谷胱甘肽动态吸附曲线Fig.1 Dynamic adsorption curve of glutathione in the presence of NaCl

由图1可知，NaCl几乎在树脂上不吸附就直接流出、浓度很快就达到最大。所以，可以考虑上柱吸附后，先用水洗出盐，再用甲醇溶液洗脱谷胱甘肽。

2.2.3 离子交换洗脱液上柱脱盐实验

图2 SP-207脱盐曲线Fig.2 Desalination curve of SP-207 type macroporous adsorption resin

80g树脂装入φ2.6cm×20cm层析柱，取50mL离子交换树脂洗脱浓缩液(谷胱甘肽含量960mg/L，在树脂最大吸附范围内，无泄漏)调节pH2.0以0.5BV上柱吸附，然后用1BV pH2.0去离子水洗脱除盐，再用70%甲醇洗脱谷胱甘肽，然后用自动部分收集器收集6mL/管后测定各管谷胱甘肽和Cl－含量，结果见图2。

由图2可知，盐峰和谷胱甘肽峰能完全分开，中间采用1BV水进行洗脱盐已经足够将盐脱除，水用量太少则两峰间会出现交叉、用量太大将延长操作时间不利于谷胱甘肽的稳定，故最终选择1BV水洗脱除盐。在此条件下，脱盐率达到99.86%、谷胱甘肽回收率65.71%，说明大孔树脂用于脱盐效果非常理想。

3 结 论

采用大孔吸附树脂对谷胱甘肽的离子交换树脂分离洗脱液进行了脱盐研究，脱盐率达到99.86%、谷胱甘肽回收率65.71%，说明大孔树脂是一种非常有效的脱盐方法。而且，大孔吸附树脂在脱盐的同时也能对谷胱甘肽起到一定的分离纯化作用。

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Macroporous Resin Adsorption for the Desalination of Glutathione-containing Eluate from Ion-exchange Resin Column

LI Cong-jun1，XIE Ai-di2
(1. Hubei Vocational College of Bio-technology, Wuhan 430070, China；2. College of Engineering and Technology, Hubei University of Technology, Wuhan 430068, China)

Q819

A

1002-6630(2010)18-0067-03

2010-06-17

李从军(1979—)，男，助教，硕士，研究方向为生物分离纯化技术。E-mail：licongjun1979@163.com