孙文敬，周延政，冯晓燕，魏 转，余泗莲，周 强

(1.江苏大学食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013；2.河北师范大学生命科学学院， 河北 石家庄 050016；3.河北化工医药职业技术学院制药工程系，河北 石家庄 050026；4.百勤异VC钠有限公司，江西 德兴 334221)

旋光法测定发酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸

孙文敬1，周延政1，冯晓燕2，魏 转3，余泗莲4，周 强4

(1.江苏大学食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013；2.河北师范大学生命科学学院， 河北 石家庄 050016；3.河北化工医药职业技术学院制药工程系，河北 石家庄 050026；4.百勤异VC钠有限公司，江西 德兴 334221)

通过测定发酵液的旋光度及其葡萄糖质量浓度，计算发酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸的质量浓度，并考察该方法实际应用的可行性。结果表明：对照品溶液的旋光度、2-酮基-D-葡萄糖酸质量浓度和葡萄糖质量浓度之间存在良好的线性关系，R2＞0.9999；该方法精密度、稳定性和重现性良好，2-酮基-D-葡萄糖酸的平均回收率为102.60%，RSD为2.17%(n=5)。该方法可用于发酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸的定量检测。

2-酮基-D-葡萄糖酸；葡萄糖；发酵液；旋光法；测定

Abstract：The 2-keto-D-gluconic acid in fermentation broth was calculated on the basis of glucose concentration determined by optical rotation degree. The application feasibility of polarimetry was also investigated. Results indicated that a good linear relationship between optical rotation degree and the concentration of 2-keto-D-gluconic acid and glucose (R2＞0.9999). The average recovery rate was 102.60% with RSD of 2.17%. This method has characteristics of precision, stability and reproducibility.Therefore, it can be used for determining 2-keto-D-gluconic acid in fermentation broth.

Key words：2-keto-D-gluconic acid；glucose；fermentation broth；polarimetry；determination

2-酮基-D-葡萄糖酸(2-keto-D-gluconic acid，2KGA)可作为饲料的富钙添加剂、洗涤剂的促净剂、水泥增塑剂和摄影显影剂等。同时，2KGA还是生产除莠化合物、糠醛、D-阿拉伯糖、D-核酮糖和D-异抗坏血酸(erythorbic acid)及其钠盐(sodium erythorbate)的前体[1]。其中，作为食品添加剂D-异抗坏血酸(钠)的前体是其最主要的用途。

在工业生产上，2KGA通常是由淀粉水解糖(葡萄糖)经细菌发酵转化而来[2]。2KGA的质量浓度是2KGA发酵过程控制的一个极其重要的参数，在整个发酵期间需要进行不断的监测。因此，建立准确、经济的2KGA定量测定方法是十分必要的。关于发酵液中2KGA的定量检测，通常采用的方法有碘量法[3]、酸碱滴定法[3]、HPLC法[1]和酶法[4]等。虽然采用HPLC法和酶法可以实现发酵液中2KGA的快速、准确测定，但因其所需仪器昂贵或试剂成本较高而难以推广；碘量法和酸碱滴定法的经济性和及时性能够符合发酵过程控制的要求，但测定结果特别容易受到发酵液中葡萄糖的干扰，导致其准确度不够。

早在20世纪40年代，Stubbs等[5]提出根据发酵液的旋光度及葡萄糖质量浓度定量检测2KGA的方法(即旋光法)。然而，限于采用的葡萄糖测定技术(Shaffer-Hartmann法)，该法并未得到普遍采用。

葡萄糖是食品工业、发酵工业及临床化学的一个常规而重要的检测指标[6]。葡萄糖氧化酶(GOD)法、己糖激酶(HK)法、葡萄糖脱氢酶(GDH)法[7-10]等酶学方法已成为葡萄糖检测的主流方法。葡萄糖的生物传感分析技术是酶学方法与生物传感器有机结合的产物，在医药、食品与发酵工业中已经得到了广泛的应用[11-12]。本研究以生物传感仪替代Shaffer-Hartmann法对葡萄糖进行检测，在此基础上对2KGA的旋光测定技术进行方法学考察，以期建立一种准确、经济的发酵液中2KGA的定量测定方法。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

2KGA发酵液：采用文献[2]方法自制；2KGA钙盐(HPLC法测定其中的2KGA含量为79.70%) 江西省德兴市百勤异VC钠有限公司；无水葡萄糖 北京精求化工有限责任公司；浓盐酸 上海国药试剂公司；其余试剂均为分析纯；实验溶液均以二次蒸馏水配制。

SBA-40型生物传感分析仪 山东省科学院生物研究所；WZZ-1SS数字式自动旋光仪、PHS-3C型pH计 上海精密仪器有限公司；AL204型电子天平 梅特勒-托利多仪器上海有限公司；80-2型离心沉淀机 巩义市予华仪器有限责任公司；CS501型超级恒温水浴器 常州诺基仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 样品溶液的制备

取一定量的2KGA发酵液，首先离心(4000r/min)20min以除去沉淀物。然后，取25mL的离心上清液与20mL的蒸馏水混合，搅动下用盐酸调节其pH值至1.5～1.6，再在60℃水浴中保温30min。用冷水将其冷却至25℃并用蒸馏水定容到100mL，再4000r/min离心30min，所得的上清液作为样品溶液。

1.2.2 对照品溶液的制备

按照表1所示的不同配比，精密称取各配比所需的无水葡萄糖和2KGA，将其分别加入45mL蒸馏水中。其他配制方法同1.2.1节样品溶液的制备，依次得到对照品溶液1～8。

1.2.3 葡萄糖分析

在25℃条件下，采用生物传感分析仪测定。

1.2.4 旋光度的测定

在25℃条件下，采用旋光仪测定。测定的光源为钠灯D线，旋光管的管长为1dm。

1.2.5 pH值的测定

采用pH计测定。

2 结果与分析

2.1 旋光度、葡萄糖及2KGA质量浓度之间的线性关系

依据Stubbs等[5]的研究结果，推测2KGA发酵液的旋光度与发酵液中的葡萄糖及2KGA质量浓度之间应该存在一定线性关系，即：

式中：Y为发酵液的旋光度/(°)；X1为发酵液中2KGA质量浓度/(g/100mL)；X2为发酵液中葡萄糖质量浓度/(g/100mL)；－0.88为1g/100mL 2KGA水溶液的旋光度/(°)；0.5275 为1g/100mL 葡萄糖溶液的旋光度/(°)。

利用Excel对对照品溶液旋光度的测定结果(表1)进行多元线性回归，可以得到线性回归方程：Y=－0.8849X1＋0.5244X2，这与Stubbs等[5]的研究结果吻合程度很高，并且R2＞0.9999，F检验与t检验的结果均为显著，说明该线性回归方程对实测值的拟合情况良好。

表1 对照品溶液的组成及其旋光度测定结果Table 1 Compositions and optical rotation degree of standard solution

2.2 精密度实验

随机抽取一种对照品溶液进行精密度实验。重复5次取样测定对照品溶液6的旋光度及葡萄糖质量浓度，其RSD值分别为0.44%和0.73%；根据所建立的线性回归方程计算对照品溶液6中的2KGA质量浓度，RSD值为0.57%，表明精密度良好(表2)。

表2 精密度实验结果Table 2 Precision determination of 2-KGA

2.3 稳定性实验

表3 稳定性实验结果Table 3 Stability determination of 2-KGA

将样品溶液在25℃分别放置0、30、60、90、120min，然后测定样品溶液的旋光度及葡萄糖质量浓度，RSD值分别为3.26%和3.17%；根据所建立的线性回归方程计算样品溶液中的2KGA质量浓度，RSD值为2.38%，可见样品溶液在2h内稳定性良好(表3)。

2.4 重现性实验

取相同的发酵液5份，按1.2.1节方法分别进行处理，测定所得各个样品溶液的旋光度及葡萄糖质量浓度，RSD值分别为0.59%和2.30%；根据所建立的线性回归方程计算样品溶液中的2KGA质量浓度，RSD值为0.62%，结果表明重现性良好(表4)。

表4 重现性实验结果Table 4 Reproducibility determination of 2-KGA

2.5 回收率实验

表5 2KGA的加标回收率和相对标准偏差Table 5 Recovery rates and RSD of spiked samples

准确量取已知2KGA质量浓度的发酵液125mL，精密加入0.6274g的2KGA钙盐(含2KGA 0.5000g，与发酵液混合前用5mL左右的蒸馏水溶解)，按1.2.1节方法制备样品溶液，平行5份。测定各个样品溶液的旋光度及葡萄糖质量浓度，并根据所建立的线性回归方程计算样品溶液中的2KGA质量浓度。计算结果表明，2KGA的5次平均回收率为102.60%，RSD为2.17%(表5)。

3 结 论

样品溶液的旋光度、2-酮基-D-葡萄糖酸质量浓度和葡萄糖质量浓度之间存在良好的线性关系。2KGA的旋光法测定技术具有精密度高、稳定性和重现性良好、操作经济的特点，可用于发酵液中2KGA的定量测定。

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Determination of 2-Keto-D-gluconic Acid in Fermentation Broth by Polarimetry

SUN Wen-jing1，ZHOU Yan-zheng1，FENG Xiao-yan2，WEI Zhuan3，YU Si-lian4，ZHOU Qiang4
(1. School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China；2. College of Life Science, Hebei Normal University, Shijiazhuang 050016, China；3. Department of Pharmaceutical, Hebei Chemical and Pharmaceutical College, Shijiazhuang 050026, China；4. Parchn Sodium Isovitamin C Co. Ltd., Dexing 334221, China)

TQ921.2

A

1002-6630(2010)22-0375-03

2010-05-05

江苏大学科研启动基金项目(08JDG029)；江西省主要学科学术和技术带头人培养计划项目(2008DD00600)；江西省科技支撑计划项目(赣财教[2008]147号)

孙文敬(1964—)，男，研究员，博士，主要从事生物化工研究。E-mail：sunwenjing1919@163.com