吴发明，李敏，俸世洪，王兵，齐景梁

（成都中医药大学药学院中药材标准化教育部重点实验室，四川 成都 611137）

不同产地火麻仁的蛋白电泳分析

吴发明，李敏*，俸世洪，王兵，齐景梁

（成都中医药大学药学院中药材标准化教育部重点实验室，四川 成都 611137）

目的：鉴定不同产地火麻仁，并探讨火麻仁的遗传多样性。方法：利用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，对不同外观性状的火麻仁进行蛋白电泳聚类分析。结果：火麻仁蛋白电泳图谱表现出可观察到的谱带18条，其中7条较明显的谱带为共有谱带，另外11条谱带具有多态性，反映了火麻仁的遗传多样性。结论：火麻仁蛋白稳定且具有丰富的遗传多样性，实验结果可为准确鉴定药用火麻仁提供辅助依据。

大麻；火麻仁；SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳

火麻仁为桑科植物大麻Cannabis sativaL.的干燥成熟果实，为传统的常用中药，具润肠通便功能，用于血虚津亏，肠燥便秘［1］。火麻仁也是重要的油料作物，其原植物的干皮在纺织原料中占有举足轻重的地位［2］。全国各地根据油用、麻用等各种用途将其分为几大类，不同地区用途不同，所选用的品种也不同，结果出现了其种质复杂、品种众多、产地混乱的现象［3］。

蛋白质作为基因的直接稳定产物，能反映生物DNA组成上的差异。种子蛋白是植物体中有高强度基因表达的一类，且能在种子内积累大量而不降解的蛋白质，其电泳谱带具有高度稳定性、专一性和叠加性。种子蛋白作为遗传标记常被用于种属间关系、种下遗传多样性分析、品种鉴定及植物繁育系统的鉴别［3］。本实验采用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，对全国不同产地、外观性状不同的火麻仁进行了蛋白电泳分析研究，为准确鉴定火麻仁药材提供理论依据。

1 材料与仪器

1.1 材料

火麻仁20个样品均于2008年收自全国不同产地。样品来源见表1，均由成都中医药大学药学院中药鉴定教研室李敏教授鉴定为桑科植物大麻Cannabis sativaL.的干燥成熟果实。

四甲基乙二胺（TEMED）、甲醇、冰醋酸、重蒸水、盐酸、甘油等；丙烯酰胺（Acr）、甘氨酸、过硫酸铵（AP）、α-巯基乙醇、N，N′-甲叉双丙烯酰胺（Bis）、十二烷基磺酸钠（SDS）、Tris碱、考马斯亮蓝R250。

表1 火麻仁样品来源

1.2 仪器

DDY-6B型稳压稳流电泳仪、30-B型电泳槽、离心机、电子天平、离心管、水浴锅、移液枪、摇床等。

2 方法

2.1 供试品溶液的制备

取火麻仁样品0.1g，去除果皮，加4倍稀释浓缩胶缓冲液，研磨匀浆，静置过夜，采用10 000r·min－1离心5min，取上清液，然后加入同等体积的样品处理液，沸水浴3min，再以8 000r·min－1离心5min，4℃保存备用［4，5］。

2.2 电泳

采用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶10%，浓缩胶5%，垂直平板电泳，加样量为25μL。电极缓冲液为Tris-Cly（pH 8.3）系统，起始电压75V，在指示剂进入分离胶后改为150V，恒压电泳，待指示剂至胶板下沿1cm左右停止电泳［5］。

2.3 染色、脱色

将取出的胶板浸泡在固定液中15min，以固定蛋白组分。倒去固定液，用重蒸水漂洗胶板，加入适量的考马斯亮蓝染色液染色40min（或摇床15min）即可，直至谱带清晰出现。倒去染色液，用重蒸水漂洗多次，加入少量的脱色液脱色，不断替换脱色液，连续多次脱色直至谱带背景清晰。完全脱色则需要振荡过夜［5］。

2.4 分析

电泳图谱见图1。根据电泳结果计算出每个品种各谱带的Rf值，用0、1表示电泳谱带的有无，在相同值位置上有蛋白质谱带的记为1，无带记为0，结果见表2。采用NTSYS2.1统计分析软件进行聚类分析，获得聚类分析图，见图2。

表2 火麻仁样品SDS-PAGE蛋白条带的Rf值

图1 火麻仁蛋白电泳图谱

图2 火麻仁蛋白电泳图谱聚类图

3 结果

火麻仁的蛋白电泳图谱共表现出较为明显的谱带18条，其中7条最为明显的谱带为共有谱带，体现火麻仁原植物种内的一致性；另外的11条谱带各样品在有无和颜色深浅度上表现出明显的多态性，反映了不同产地火麻仁水溶性蛋白质的种类和含量存在差异。

从聚类结果可以看出，地域上比较接近的火麻仁在遗传性状上基本相近，如第一类1和10号两个样品都产自四川；第二类中3、9、11号样品都产自甘肃，8和15号样品均产自山西，6号样品产自陕西，均为北方产样品，除此之外，其他样品均产自西南地区的四川、贵州、云南三省；第三大类16号样品比较特殊，单独为一类；第四类17、18、19号样品均产自甘肃西北地区。

4 讨论

火麻仁药材的蛋白质种类是稳定的。这可能与植物在长期的生育中是靠种子来保持植物的遗传特性相关。利用蛋白质种类和含量的不同，鉴别果实及种子类药材，在理论上是有根据的。

目前对火麻仁的比较研究基本还停留在表现型水平，虽然外观形状是遗传主要标记之一，但它无法明确各火麻仁的遗传关系。火麻仁蛋白电泳结果既反映了火麻仁原植物种内的一致性，也反映了不同产地火麻仁之间存在着的遗传多样性。可见通过长期的地域性人工选育驯化、栽培，使得火麻仁的外观性状和内在基因都在各地域内发生了较大的变化，各基因控制的优良性状在不同产地形成了不同表型，突显了植物体内在基因和外在性状之间的关系和环境因素对基因和外观性状的影响，同时也反映了长期的引种栽培造成了大麻品种的严重混乱，蛋白电泳从内在基因上对各产地大麻的亲缘关系进行分类，具有科学性、客观性。本实验以外观性状为基础，从分子水平上为药用火麻仁品种鉴定和育种提供基础理论依据。

［1］国家药典委员会.中国药典（一部）［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：74.

［2］赵铭森，康红梅.关于发展大麻产业的研究［J］.安徽农学通报，2007，13（10）：128-129.

［3］张涛.我国大麻种植利用情况分析［J］.云南警官学院学报，2008，4（69）：38-40.

［4］孙稚颖，周凤琴，郭庆梅.山东产不同农家品种瓜蒌的种子蛋白电泳分析［J］.时珍国医国药，2005，16（12）：1224-1225.

［5］汪家政，范明.蛋白技术手册［M］.北京：科学出版社，2000：77-100.

Analysis of Cannabis Semen Properties and Protein Electrophoresis from Its Different Habitats

Wu Faming，Li Min，Feng Shihong，WangBing，Qi Jingliang
（College of pharmacy，Chengdu University of TCM，The Ministry of Education Key Laboratory of Standardization of Chinese crude drug，Chengdu Sichuan611137，China）

Objective：To Identify the species and affinities of cannabis semen from different habitats，and investigate the relationships between heredity diversity and apparent property.Methods：Apply the SDS-polyacrylamide electrophoresis technology for the first time to take protein electrophoresis cluster analysis on the cannabis semen varied from apparent property.ResultsEighteen obvious spectral bands could be observed in the cannabis semen protein electrophoretogram，among which seven obvious and shared bands manifest inter-species consistency in cannabis semen.And the other eleven bands manifest the genetic polymorphism of cannabis semen.ConclusionProtein of cannabis semen is stable and it has heredity diversity in abundance.The experimental result can provide theoretical support for the identification of medicinalCannabis sativaL..

Cannabis sativaL.；Cannabis semen；SDS-polyacrylamide electrophoresis

*李敏，E-mail：028limin＠163.com

2010-02-28）