刘 剑 娜， 朱 靖 博， 闫 海 全， 王 妍 妍

( 1.大连工业大学 生物与食品工程学院， 辽宁 大连 116034;2.成都理工大学 材料与化学化工学院， 四川 成都 610059 )

0 引 言

三七是我国传统名贵中药材[1-2]，具有活血化瘀、消肿定痛[3]的奇效。三七皂苷主要含有二醇型人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd，三醇型人参皂苷Re、Rg1、Rg2、Rh1等，其中皂苷Rg1和Rb1具有活血、改善脑循环、镇静、镇痛等功效[4-5]。对于高纯度三七皂苷单体制备已有报道，其中以色谱法分离效果最佳，但现有分离填料的选择多集中在大孔树脂、葡聚糖凝胶，分离获得的单体纯度较低、物质量较少。本研究采用正相硅胶柱色谱分离和反相C18柱色谱纯化的方法制备人参皂苷Rg1和Rb1。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

三七总皂苷；甲醇、乙腈，色谱纯；所用其他试剂均为AR级。Ultimate 3000型高效液相色谱仪，电子精密天平，10、50 L旋转薄膜蒸发仪，薄层色谱硅胶预制板。

1.2 方 法

1.2.1 填料的预处理

薄层层析硅胶在100～120 ℃烘干24 h，再升高150 ℃烘干6 h，冷却后使用。

1.2.2 薄层色谱定性分析

以正丁醇-乙酸乙酯-水[V(正丁醇)∶V(乙

酸乙酯)∶V(水)= 4∶1∶5]作为展开剂，10%硫酸显色。每组馏分进行薄层检测，根据Rf值，合并馏分溶液。

1.2.3 液相色谱定量分析

1.2.3.1 色谱条件

色谱柱，Kromasil C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；体积流量，1.00 mL/min；检测波长，197 nm；柱温，室温；进样量，20 μL。采用二元梯度洗脱，流动相为乙腈和水。洗脱比例：乙腈体积分数10%(0 min)→20%(5 min)→35%(8 min)→65%(10 min)→75%(50 min)。三七总皂苷液相色谱图见图1，图中Rb1保留时间31.3 min，Rg1保留时间11.2 min。

图1 三七总皂苷高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of crude saponins from panax notoginseng

1.2.3.2 样品制备

对照品溶液：精密称取Rg1和Rb1对照品各1.00 mg 置10 mL量瓶中用甲醇溶解，定容至刻度；再精密吸取1.0 mL置10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，配制成质量浓度为10 μg/mL的溶液。

供试品溶液：精密称取三七总皂苷粉末适量，置25 mL的容量瓶中，用流动相溶解超声助溶，充分溶解后，微孔滤膜滤过备用。

1.2.3.3 标准曲线的绘制

精密吸取Rg1和Rb1对照品溶液 (10 μg/mL) 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL分别置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。按上述色谱条件，分别精密吸取20 μL注入液相色谱仪，测定峰面积，以对照品的质量浓度 (μg/mL)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程：YRg1=2.64×10X+1.237，r2=0.999 8；YRb1= 4.19×10X+5.568，r2=0.999 5。

1.2.3.4 质量分数测定

精密吸取供试品溶液20 μL，高效液相色谱测定Rg1和Rb1峰面积；通过标准曲线方程计算含量，Rg1质量分数为10%，Rb1质量分数为21%。

2 结果和讨论

2.1 化合物的分离

采用正相硅胶柱分离:常压玻璃柱(6 cm×60 cm)，硅胶100～200目，体积流量30 mL/min，流动相二氯甲烷-甲醇[V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=10∶1、10∶2、10∶3、10∶4、10∶5]，每个梯度10 L溶剂，共收集115瓶(500 mL/瓶)。根据TLC检测，合并Rf值相同点的馏分溶液，得到4个馏分。馏分Zd1主要是低极性的皂苷；馏分Zd2主要含有Rg1，保留时间11.3 min，面积百分比为52.3%；馏分Zd3主要含有Rb1，保留时间31.3 min，面积百分比为67.2%；馏分Zd4主要是高极性的皂苷。

馏分Zd2和馏分Zd3分别采用硅胶进行二次柱层析，分离条件：硅胶柱(6 cm×60 cm)，200～300目，流动相二氯甲烷-甲醇[V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=100∶3、100∶5、100∶8、100∶10]；每个梯度10 L溶剂。根据HPLC检测，Rb1纯度可提高到76.2%，Rg1纯度可提高到62.3%。图2为两种皂苷的洗脱曲线。Rb1的洗脱液为体积比为10∶3的二氯甲烷-甲醇溶液，Rg1的洗脱液为体积比为10∶1的二氯甲烷-甲醇溶液。

图2 Rb1和Rg1洗脱曲线Fig.2 Elution curves of Rb1 and Rg1

2.2 化合物的纯化

2.2.1 纯化填料的选择

选择反相填料Sephadax LH-20，树脂CG161，C18。用水溶解样品，流动相先用水洗脱，再用体积分数为5%～100%的甲醇水溶液梯度洗脱。TLC检测，表1为3种反相填料洗脱结果。

2.2.2 反相C18柱色谱纯化

采用高压制备色谱柱(40 mm×30 mm，15 μm C18填料)，流动相甲醇-水洗脱，HPLC检测，结果如图3所示。对二次硅胶分离的样品进行纯化分离，结果如表2所示。由图3看出，Rg1的主要洗脱液为体积分数为60%的甲醇水溶液，Rb1的主要洗脱液为体积分数为80%甲醇水溶液。

表1 反相纯化分离填料的选择Tab.1 Selection of packing material

表2 Rb1和Rg1的分离结果Tab.2 Results of isolation of the Rb1 and Rg1

图3 Rb1和Rg1洗脱曲线Fig.3 Elution curves of Rb1 and Rg1

2.3 化合物的鉴定

对纯化的样品进行HPLC分析，结果见图4，Rb1样品峰与对照品人参皂苷Rb1的保留时间均为31.3 min，Rg1样品峰与对照品人参皂苷 Rg1的保留时间均为11.3 min，且其紫外光谱图相同，可以确定分离纯化的化合物为Rb1和Rg1。

图4 皂苷Rb1、Rg1的制备品和标准品液相色谱图Fig.4 Chromatograms of Rb1, Rg1 sample and standards

3 结 论

本研究建立了正相硅胶层析，反相C18色谱纯化制备分离三七皂苷Rg1、Rb1的方法。从三七总皂苷中分离得到的三七皂苷Rg1纯度为90.3%，Rb1纯度为95.2%。该方法分离成本低、效率高，为三七皂苷的大规模生产制备、药理实验和临床实验等研究奠定了基础。

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